基于UDPG原位再生体系合成红景天苷的研究

作     者：姜梦嫣 

作者单位：北京农学院 

学位级别：硕士

导师姓名：马兰青;张明程

授予年度：2018年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：蔗糖合酶 尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶 融合基因 原位再生 红景天苷 

摘      要：红景天苷是红景天植物的有效成分,具有抗辐射、抗缺氧、抗疲劳、抗氧化等作用。单纯依靠野生红景天植物提取红景天苷已无法满足日益增长的需求量,而人工栽培红景天受多方面限制,化学合成法因大量使用有机溶剂而使其安全性堪忧。近年来,生物法合成红景天苷成为研究热点,但研究多注重于增加底物酪醇的供应量和尿苷二磷酸糖基转移酶的高效表达,常常忽略另一底物尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的供应。本研究糖合酶可以UDP为底物产生UDPG的原理;利用基因融合的方法构建了蔗糖合酶(SuSy)与尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UGT)的融合酶;通过在大肠杆菌中重组表达融合酶而建立UDPG的原位再生体系,以实现红景天苷的生物合成。研究首先克隆获得了拟南芥蔗糖合酶AtSUS1基因和高山红景天尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶UGT72B14基因;然后依据宿主大肠杆菌密码子偏好性等对所克隆的两个基因序列进行了优化处理,并以酶切位点相连法设计GSG三个氨基酸链接肽序列,将优化后序列连接获得融合基因AtSUS1-3a-UGT72B14,成功构建重组质粒pET28a-AtSUS1-3a-UGT72B14,并转化至大肠杆菌宿主感受态细胞BL21(DE3)中获得重组菌株;之后对重组菌融合蛋白诱导表达条件进行优化,当菌体浓度OD=0.6时添加终浓度为0.6 mM的IPTG,温度设置为16℃进行诱导表达18 h,获得表达量和纯度较理想的重组蛋白;最后经过纯化后进行了重组蛋白的体外酶促反应,反应液经HPLC检测,结合标准曲线计算得到红景天苷的浓度为9.17μg/ml,根据体外酶促反应体系,在酪醇过量的情况下,反应产物相对底物(蔗糖+UDP)的转化率为69.26%。证实了融合体系的运行可以获得产物红景天苷。