检索结果-南通市图书馆

小麦蓝矮植原体SWP6蛋白抑制本氏烟坏死功能的研究

维普期刊数据库

同方期刊数据库博看期刊评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

小麦蓝矮植原体SWP6蛋白抑制本氏烟坏死功能的研究

作者：陈遇嘉西北农林科技大学

学位级别：硕士

小麦蓝矮病(Wheat blue dwarf disease,WBD)是发生在我国西北地区冬小麦上的植原体病害。早在上世纪50年代,该病害首次在陕西报道,之后扩展到甘肃,宁夏和山西等地。小麦蓝矮病是由小麦蓝矮植原体侵染引起的病害,由介体昆虫异沙叶蝉(Psam... 详细信息

小麦蓝矮病(Wheat blue dwarf disease,WBD)是发生在我国西北地区冬小麦上的植原体病害。早在上世纪50年代,该病害首次在陕西报道,之后扩展到甘肃,宁夏和山西等地。小麦蓝矮病是由小麦蓝矮植原体侵染引起的病害,由介体昆虫异沙叶蝉(Psammotettix alienus L.)传播,近些年由于麦草覆盖技术的推广,使得介体昆虫越冬基数增加,该病害逐渐扩展到黄河中下游干旱区,给小麦生产带来严重损失。本实验室采用Solexa DNA测序方法完成了小麦蓝矮植原体的基因组图谱,对预测的37个分泌蛋白进行了抑制子的筛选和致病性分析,筛选到SWP6蛋白可以抑制BAX引起的本氏烟细胞过敏性坏死反应。然而,SWP6蛋白的功能及作用机理尚未明确,本论文针对小麦蓝矮植原体SWP6蛋白开展了关键功能域鉴定,转录组测序以及亚细胞定位等一系列试验,旨在能够明确SWP6蛋白的功能,取得以下试验结果:1.对SWP6蛋白的同源性、理化性质和空间结构等进行了分析预测。明确了SWP6基因全长618 bp,编码206个氨基酸,编码蛋白分子量大小约为23.8 kDa,等电点pI为6.98,多肽原子组成为CHNOS,疏水性系数为0.120,属于疏水性蛋白。其信号肽切割位点在蛋白N端第30-31个氨基酸,分泌到胞外成熟的分泌蛋白有174个氨基酸,分子量大小约为19.6 kDa。SWP6蛋白包含所有常见的20种氨基酸,其中天冬氨酸含量最高,比例为13.6%。在第10-30个氨基酸之间存在跨膜区域,二级结构预测SWP6蛋白有3个α螺旋和多个无规则卷曲结构。2.以SWP6的生物信息学分析预测为基础,构建了SWP6的5个功能域缺失突变体。分别命名为pGR107-SWP6DH1、pGR107-SWP6DH2、pGR107-SWP6DH3、pGR107-SWP6DH4、pGR107S-WP6DH5。利用农杆菌介导的外源基因在本氏烟中的瞬时表达技术,在本氏烟中分别瞬时表达5个缺失突变体,通过观察本氏烟叶片症状和对接种叶RT-PCR的检测,明确了SWP6蛋白中第84-113个氨基酸对其行使功能发挥了关键作用。以pCAMBIA1302为骨架载体构建了SWP6和eGFP融合的亚细胞定位表达载体,通过农杆菌介导外源基因在本氏烟中瞬时表达SWP6和eGFP的融合蛋白,确定了SWP6定位在本氏烟细胞膜中。3.通过对SWP6瞬时表达的本氏烟转录组测序结果的初步分析,筛选到差异表达基因有1093个,其中,上调表达基因540个,下调表达基因553个。挑选4个上调和4个下调关键基因进行了qRT-PCR验证,结果表明这些基因差异表达倍数均与测序结果相吻合,为后续SWP6功能的进一步验证提供基础。

关键词：小麦蓝矮植原体 SWP6 功能域寄主免疫反应

小麦蓝矮植原体SWP11激发子调控寄主防御反应的分子机理研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

小麦蓝矮植原体SWP11激发子调控寄主防御反应的分子机理研究

作者：张元乐西北农林科技大学

学位级别：硕士

小麦蓝矮植原体(Wheat blue dwarf phytoplasma)属于植原体暂定种16Sr I组(安凤秋等2006),通过条沙叶蝉(Psammotettix striatus.)传播,寄生于植物维管束细胞中。由小麦蓝矮植原体引起的小麦蓝矮病(Wheat blue dwarf disease,WBD),是一... 详细信息

小麦蓝矮植原体(Wheat blue dwarf phytoplasma)属于植原体暂定种16Sr I组(安凤秋等2006),通过条沙叶蝉(Psammotettix striatus.)传播,寄生于植物维管束细胞中。由小麦蓝矮植原体引起的小麦蓝矮病(Wheat blue dwarf disease,WBD),是一种主要发生在我国西北地区的重要病害,会引起小麦产生黄化、矮缩等症状,进而造成减产甚至绝产,严重威胁着我国小麦生产。本实验室前期研究发现WBD植原体可以编码37个分泌蛋白,通过瞬时表达筛选出可以引起本氏烟(Nicotiana benthamiana)过敏性坏死的效应蛋白SWP11,其对植物防止WBD植原体的增殖和扩散具有重要意义。为深入了解SWP11引起寄主植物细胞坏死的机理,我们对SWP11进行了生物信息学分析、亚细胞定位和表达坏死症状的寄主种类鉴定,然后以本氏烟为模式植物,筛选了与SWP11互作的因子,并进行了鉴定,取得的主要结果如下:1.对SWP11蛋白进行了生物信息学分析。明确SWP11基因全长为375bp,编码氨基酸125个。SWP11蛋白不稳定系数50.55,平均疏水系数-0.650,属于不稳定蛋白和亲水蛋白,但N端存在疏水性结构;有两个主要的α-螺旋,N端第10-30位氨基酸之间存在跨膜区域,并且第31-32位氨基酸之间存在信号肽切割位点,切除信号肽后无额外跨膜区,属于分泌蛋白,成熟的蛋白有93个氨基酸。2.对SWP11蛋白进行了亚细胞定位并初步鉴定了SWP11蛋白表达坏死症状的寄主种类。构建了融合蛋白表达载体p CAMBIA1302-e GFP-SWP11,并同时将核定位信号、核输出信号和核输出信号功能缺失序列融合到SWP11的C端,构建重组载体p CAMB IA1302-e GFP-SWP11-NLS、p CAMBIA1302-e GFP-SWP11-NES、和p CAMBIA1302-e GFP-SWP11-NESKO。转化农杆菌后注射本氏烟,观察其定位情况,发现SWP11同时定位在细胞核和细胞膜,并发现SWP11诱导本氏烟坏死需要其定位在细胞膜上。将含p GR107-SWP11质粒的农杆菌注射植物,发现SWP11可以诱导番茄、辣椒、本氏烟、拟南芥产生过敏性坏死反应。3.使用AP-SWATH和酵母双杂交筛选到了本氏烟中与SWP11互作的靶标。通过AP-SWATH(Affinity purification Sequential Window Acquisition of all Theoretical fragme-ntions)技术进行了SWP11的互作蛋白筛选,获得了165个靶标蛋白。构建了分裂泛素酵母双杂膜系统(split-ubiquitin membrane system)的诱饵载体p BT3-SUC-SWP11和p BT3-STE-SWP11,通过验证发现两个载体均可以进行筛库工作。用p BT3-SUC-SWP11筛选本氏烟文库,初步筛选出了87个互作蛋白。两种方式筛选到的互作蛋白十分类似,均存在叶绿素结合蛋白、叶绿体光系统Ⅰ和Ⅱ的成员亚基、核糖体蛋白、细胞色素蛋白、热击蛋白、ATP酶亚基、过氧化物酶、糖类代谢酶、磷酸糖代谢酶、氨基酸-t RNA连接酶或代谢酶。4.选取了互作蛋白中与过氧化氢代谢有关的两个靶标蛋白:过氧化物酶Nb Prx03(Nicotiana benthamiana Peroxidase 3)与Nb Prx63(Nicotiana benthamiana Peroxidase63),通过酵母双杂交实验确定了其与SWP11的互作关系。通过生物信息学软件和在线数据库对其进行了分析,发现Nb Prx03与Nb Prx63同源率很低,但同为血红素过氧化物酶,属于非动物过氧化物酶超家族(Non Animal peroxidase superfamily)中的Ⅲ类过氧化物酶(ClassⅢperoxidases,CⅢPrxs),两者功能类似,均拥有血红素结合功能、金属离子(Ca)结合功能和过氧化物酶活性,都参与过氧化氢的分解代谢和对氧化应激的反应,功能位点存在微小的差别。两者均拥有信号肽,Nb Prx03的N端存在与信号肽重合的跨膜区,Nb Prx63无跨膜区,定位部位均是细胞外,和大多数CIII Prxs一致,属于分泌蛋白。

关键词：小麦蓝矮植原体分泌蛋白 SWP11 NbPrx03 NbPrx63 过敏性坏死

小麦蓝矮植原体效应蛋白SWP1与转录因子TCP12的互作研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

小麦蓝矮植原体效应蛋白SWP1与转录因子TCP12的互作研究

作者：羊海珍西北农林科技大学

学位级别：硕士

由植原体侵染引起的小麦蓝矮病(wheat blue dwarf disease,WBD)是威胁小麦生产的一种重要病害,主要发生在我国的西北地区,给农业造成了巨大的损失。前期研究发现,WBD植原体可以编码多个分泌蛋白(SWP),其中SWP1可以引起本氏烟和拟南芥侧... 详细信息

由植原体侵染引起的小麦蓝矮病(wheat blue dwarf disease,WBD)是威胁小麦生产的一种重要病害,主要发生在我国的西北地区,给农业造成了巨大的损失。前期研究发现,WBD植原体可以编码多个分泌蛋白(SWP),其中SWP1可以引起本氏烟和拟南芥侧枝增多,是一个关键的致病效应蛋白。为了深入了解SWP1效应蛋白引起侧枝增多的分子机理,我们对SWP1与植物因子的互作进行了研究。TCP家族转录因子中的classⅡ亚类对植物叶片形态建成、分枝发育等过程具有重要的调控作用,其中的一些成员能与SWP1的同源蛋白——翠菊黄化植原体侧枝增多株系编码的SAP11蛋白以及苹果丛生植原体编码SAP11-like蛋白发生互作。为此,本文首先采用酵母双杂技术探究了SWP1效应蛋白与拟南芥ClassⅡTCP家族所有成员的互作关系,并围绕其中一个与分枝调控相关的互作靶标AtTCP12,展开其与SWP1的互作机理研究。主要研究结果如下:1.克隆了拟南芥ClassⅡTCPs家族的11个转录因子,并成功构建到酵母双杂诱饵载体pGADT7上。将11个诱饵质粒pGADT7-TCPs分别与猎物质粒pGBKT7-SWP1共转化酵母细胞,通过观察转化子在营养缺陷型培养中的生长情况分析互作关系。结果显示SWP1能与其中的5个转录因子:TCP1、TCP2、TCP4、TCP12、TCP18、TCP24相互作用,与其余6个转录因子不互作。2.采用双分子荧光互补(BiFC)技术,进一步证明了SWP1能与AtTCP12互作,且互作发生在细胞核内。在本氏烟中共表达融合了红色荧光蛋白mCherry的AtTCP12和融合了绿色荧光蛋白GFP的SWP1,共聚焦显微镜观察发现SWP1与At TCP12共定位于细胞核。3.为了明确SWP1与AtTCP12互作中的关键结构域,构建了两个AtTCP12的缺失突变体AtTCP12△TCP、AtTCP12△R,酵母双杂验证其与SWP1的互作关系;构建三个SWP1的缺失突变体SWP1△NLS、SWP1△CC、SWP1△N,验证与AtTCP12的互作关系。结果表明,AtTCP12的TCP结构和SWP1的卷曲螺旋(CC)结构在两个蛋白的互作中发挥关键作用。4.采用实时荧光定量PCR检测了野生型和SWP1转基因拟南芥株系中AtTCP12的转录水平,结果表明SWP1的两个转基因株系中AtTCP12的mRNA水平都低于野生型。在本氏烟中共表达GFP-SWP1和3HA-AtTCP12,并以共表达GFP与3HA-AtTCP12为对照。Western blot和半定量RT-PCR的结果显示,与对照组相比,共表达SWP1的样品中AtTCP12的mRNA水平和蛋白水平均下调。综上所述,SWP1效应蛋白通过与AtTCP12转录因子互作,负调控AtTCP12的表达,干扰其正常功能的发挥,是SWP1引起拟南芥侧枝增多重要原因。

关键词：小麦蓝矮植原体效应蛋白SWP1 AtTCP12 TCP转录因子

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

小麦蓝矮植原体RNA沉默抑制子的鉴定

小麦蓝矮植原体RNA沉默抑制子的鉴定

作者：陈文宝西北农林科技大学

学位级别：硕士

RNA沉默抑制子通过抑制或者干扰寄主RNA沉默通路,提高了病原物侵染效率。到现在,研究已表明病毒、细菌和真菌均可编码RNA沉默抑制子。沉默抑制子的研究在揭示病原物与寄主互作,以及在病害防控上均有较大意义。植原体也可能也编码RNA沉... 详细信息

RNA沉默抑制子通过抑制或者干扰寄主RNA沉默通路,提高了病原物侵染效率。到现在,研究已表明病毒、细菌和真菌均可编码RNA沉默抑制子。沉默抑制子的研究在揭示病原物与寄主互作,以及在病害防控上均有较大意义。植原体也可能也编码RNA沉默抑制子去提高自身侵染的效率。但到目前,植原体上没有RNA沉默抑制子相关的研究报道。随着小麦蓝矮基因组测序的完成,为我们鉴定提供了可能,因此我们对小麦蓝矮植原体编码的分泌蛋白进行了RNA沉默抑制活性鉴定,主要结果如下:(1)克隆了WBD 37个分泌蛋白DNA基因,分别将其成功构建到植物表达载体pBI121上,并成功转化到农杆菌GV3101中。(2)分别将构建好的37个分泌蛋白植物表达载体同pBI121-GFP共浸润4-5叶期16c本氏烟叶片,同时以浸润pBI121-GFP和pBI121空载体的本氏烟植株为阴性对照,以pBI121-P19和pBI121-GFP为阳性对照。在紫外灯下进行表型筛选,结果表明SWP16能抑制GFP诱发的系统沉默,其他蛋白在局部和系统上都没有表现出抑制活性。同时通过荧光定量和western blot分别从RNA水平和蛋白水平进行了验证,证实了SWP16的抑制子活性。(3)为了检验SWP16的抑制活性,将SWP16基因重组到PVX载体上,通过试验发现PVX-SWP16浸润本氏烟后,在10天时上部叶片和系统叶片均出现严重的花叶、卷曲等症状,而阴性对照上部叶片花叶和卷曲症状较轻。我们选取PVX病毒外壳蛋白CP基因定量分析发现:浸润了PVX-SWP16叶片的PVX-CP含量要显著高于浸润了PVX空载体的含量,约为1600倍。该结果表明SWP16不仅加重了PVX致病性而且还增加了PVX病毒的积累,是一个植物病害的加重因子。(4)在mRNA水平检测SWP16在抑制寄主沉默过程中RNA沉默通路上相关基因的表达量,包括Nb DCL1-4、Nb AGO1、Nb AGO2。在1 dpi后,RNA沉默通路中的DCL1,DCL2,DCL3,DCL4,AGO2都下调表达,因此推测SWP16可能作用于DCL,AGO合成的相关通路,并抑制RNA沉默相关基因的表达。在2 dpi后,DCL1,DCL2,DCL3,AGO2仍下调表达。在4 dpi后,全部基因都显著的上调表达,这可能由于SWP16主要不是通过抑制DCL、AGO基因表达发挥抑制活性,而是主要通过抑制沉默信号的传导发挥抑制活性。通过构建亚细胞定位表达载体PCAMBAI1302-SWP16定位了SWP16,SWP16主要分布在细胞质中,尤其集中分布在细胞膜上。另外,少量SWP16少量定位在细胞核上。构建PCAMBAI1302-SWP16,SWP16主要定位在细胞核和细胞膜上。亚细胞定位结果也证明了SWP16可能通过抑制沉默信号的系统传导发挥抑制活性。

关键词：小麦蓝矮植原体 RNA沉默 RNA沉默抑制子分泌蛋白

小麦蓝矮植原体效应蛋白SWP1功能域的鉴定分析

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

小麦蓝矮植原体效应蛋白SWP1功能域的鉴定分析

作者：刘文婷西北农林科技大学

学位级别：硕士

小麦蓝矮植原体病害主要发生在小麦上,其常发地集中在我国陕西、山西、内蒙古、宁夏和甘肃等西北地区,这种病害严重的威胁了小麦的生长,造成产量和质量的严重损失。近几年来,小麦蓝矮植原体开展的研究工作主要是围绕其全基因组的测序及... 详细信息

小麦蓝矮植原体病害主要发生在小麦上,其常发地集中在我国陕西、山西、内蒙古、宁夏和甘肃等西北地区,这种病害严重的威胁了小麦的生长,造成产量和质量的严重损失。近几年来,小麦蓝矮植原体开展的研究工作主要是围绕其全基因组的测序及致病机制的探索。通过生物信息学软件对小麦蓝矮植原体基因组序列进行分析比较,预测到525个与编码蛋白相关的基因,其中大部分与其他植原体编码蛋白的基因同源,但是也有22种比较特异的基因,同时也分析预测到37个分泌蛋白,并进行了致病性的鉴定,发现SWP1侵染的本氏烟会表现出植株底部分枝增多的症状。本论文针对SWP1进行相关的生物信息学分析并构建不同的关于SWP1的缺失突变体,旨在明确能够引起本氏烟出现底部分枝增多现象的关键区域。具体的实验结果如下:1.对SWP1基因编码蛋白的基本生物学特性和结构进行分析预测:SWP1基因编码的蛋白大小为13.292kDa,等电点pI为9.2,属于碱性蛋白,信号肽的切割位点在SWP1蛋白N端的第33与第34个氨基酸之间,成熟以后分泌到胞外去除信号肽的蛋白大小为9.516 kDa。通过PSIPRED在线软件分析SWP1蛋白的二级结构,结果表明SWP1蛋白主要是在整个氨基酸序列的6-24、48-65、68-79、82-99处形成四个α螺旋。同时,分析预测出在整个氨基酸序列的第82-101个氨基酸处形成一个卷曲螺旋结构并在C末端的存在一个单分型的核定位信号。2.以SWP1生物信息学的结果为基础,构建了SWP1△NLS、SWP1△NLSCC、SWP1△CC、SWP1△N、SWP1△NC这五个缺失突变体,并利用农杆菌介导的植物表达载体在本氏烟中进行表达,通过对本氏烟的症状进行分析,发现缺失了SWP1 C端的卷曲螺旋结构,本氏烟将不再表现出丛枝的症状,而缺失SWP1 C端包含核定位信号在内的10个氨基酸及N端的14个氨基酸并不会影响SWP1功能的发挥,因此,推断SWP1C端的卷曲螺旋结构是其发挥功能的关键。3.在明确了卷曲螺旋结构是SWP1发挥功能的关键部位后,进一步构建了SWP1△NC1、SWP1△NC2、SWP1△NNLSCC这三个缺失突变体,并在本氏烟中进行表达,结果显示缺失卷曲螺旋结构中的第11-15个氨基酸,本氏烟将不会出现分枝增多的症状,因此,推断这5个氨基酸是卷曲螺旋结构中关键的活性区域,同时也是SWP1发挥功能的关键区域。

关键词：小麦蓝矮植原体 SWP1 缺失突变体功能域丛枝

小麦蓝矮植原体RNA沉默抑制子SWP16互作蛋白的筛选及功能初探

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

小麦蓝矮植原体RNA沉默抑制子SWP16互作蛋白的筛选及功能初探

作者：杨彦君西北农林科技大学

学位级别：硕士

植原体(phytoplasma)是一种形态不规则且无细胞壁的单细胞原核生物,据统计,全世界由植原体引发的植物病害多达800多种,我国有100余种。我国对植原体病害的报道早在明末《沈氏农书》中就有桑萎缩“凡桑一癃,再无医法,断不可留者”的记载... 详细信息

植原体(phytoplasma)是一种形态不规则且无细胞壁的单细胞原核生物,据统计,全世界由植原体引发的植物病害多达800多种,我国有100余种。我国对植原体病害的报道早在明末《沈氏农书》中就有桑萎缩“凡桑一癃,再无医法,断不可留者”的记载,其对经济林木以及农作物造成严重的经济损失。其中,小麦蓝矮植原体(WBD phytoplasma)是我国首次报道的小麦植原体病害,可引起植株矮化、丛枝增多、叶尖发黄等症状,感病植株大多因不能正常抽穗而不结实,导致西北干旱麦区减产,发病较重的麦区产量损失可达到60%～80%,甚至绝收。因此,对小麦蓝矮植原体致病机制、植原体与寄主互作关系及其防控技术的研究至关重要。本实验室前期测序完成了小麦蓝矮植原体基因组图谱,并通过RNA沉默抑制子鉴定系统对预测到的37个分泌蛋白进行鉴定,发现效应蛋白SWP16具备抑制系统性RNA沉默的功能,并且显著促进PVX侵染,因此初步确定其为一个具有活性的RNA沉默抑制子(RNA silencing suppressor)。目前,国内外对植原体RNA沉默抑制子的鉴定及其与寄主的互作蛋白均无相关研究报道,因此本实验以寻找沉默抑制子SWP16的互作蛋白为切入点,通过酵母双杂交方法筛得候选蛋白并结合酵母一对一验证、Bi FC、共定位(免疫荧光)及荧光强度分析实验确定互作,进而通过VIGS及过表达技术找到关键互作蛋白,揭示WBD植原体沉默抑制子的作用机制,取得的主要研究结果如下:(1)互作蛋白的筛选与生物信息学分析。利用分离泛素酵母双杂交膜系统,以p BT3STE-SWP16为诱饵,从小麦文库中共获得22种互作蛋白,复筛验证和α-半乳糖苷酶检测结果显示,22种候选蛋白全部与SWP16互作。对候选蛋白进行GO注释分析后结合转录组测序结果,初步选择细胞色素B561、核酮糖二磷酸羧化酶小亚基PW9、小麦水通道蛋白TIP2、S期激酶相关蛋白1(SKP1)等4种可能与沉默通路相关的靶标蛋白,进一步验证互作。(2)利用酵母双杂交(Y2H)、Bi FC及共定位(免疫荧光)实验确定了4种候选蛋白与沉默抑制子SWP16的互作关系。克隆4种候选蛋白的CDS序列进行酵母双杂交实验,结果表明4种候选蛋白均与沉默抑制子SWP16存在相互作用,双分子荧光互补(Bi FC)实验表明,SWP16与4种候选蛋白主要在膜上互作,共定位(免疫荧光)实验进一步验证了互作结果。其中SKP1作为SCF(Skp1-Cul1-F-box)泛素连接酶复合体的接头蛋白可能在沉默通路中发挥重要影响,因此通过荧光强度分析实验进一步确定了SWP16促进SKP1基因的表达。(3)利用VIGS及基因过表达(overexpression)技术探究SKP1对SWP16功能的影响。构建病毒诱导的基因沉默载体TRV2-Nb SKP1,在沉默Nb SKP1基因后,过表达PBI121-GFP和PBI121-SWP16,25天后在紫外灯下观察本氏烟16c表型,结果表明此时SWP16不再发挥系统性沉默抑制子功能,并通过RT-q PCR及蛋白定量的方法检测GFP的相对表达量,检测结果与表型结果一致,表明SKP1在SWP16发挥系统性沉默抑制子功能的过程中起关键作用。综上所述,本实验通过酵母双杂交筛库共获得22种互作蛋白,其中4种可能与系统性沉默相关,经分析鉴定得出,SKP1是小麦蓝矮植原体RNA沉默抑制子SWP16发挥功能的关键互作蛋白,对Nb SKP1基因的沉默可直接导致SWP16沉默抑制子功能的丧失,推测SWP16需要借助SKP1来逃避植物的识别及降解以维持自身稳定,或是间接影响其他通路来抑制沉默复合体的形成。本研究为首次筛选植原体RNA沉默抑制子的互作蛋白,有助于进一步解析小麦蓝矮植原体的致病机理并探索出植原体病害防控新技术。

关键词：小麦蓝矮植原体 RNA沉默抑制子分离泛素酵母双杂交 SKP1

ATP6蛋白影响异沙叶蝉对小麦蓝矮植原体的传播效率

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

昆虫学报 2021年第11期64卷 1275-1282页

作者：丁磊陆文静杨彦君马欢吴云锋西北农林科技大学植物保护学院旱区作物逆境生物学国家重点实验室农业部西北黄土高原作物有害生物综合治理重点实验室陕西杨凌712100 黑龙江省农业科学院水稻研究所黑龙江佳木斯154026

【目的】探索异沙叶蝉Psammotettix alienus ATP6蛋白对小麦蓝矮植原体(wheat blue dwarf phytoplasma,WBDp)传播效率的影响。【方法】将异沙叶蝉mRNA反转录合成cDNA,构建分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库;用WBDp的虫传相关蛋白P2-4为... 详细信息

【目的】探索异沙叶蝉Psammotettix alienus ATP6蛋白对小麦蓝矮植原体(wheat blue dwarf phytoplasma,WBDp)传播效率的影响。【方法】将异沙叶蝉mRNA反转录合成cDNA,构建分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库;用WBDp的虫传相关蛋白P2-4为诱饵,从异沙叶蝉cDNA文库杂交筛选互作蛋白;通过RNAi沉默ATP6基因,验证ATP6蛋白对异沙叶蝉3龄若虫传播WBDp的影响。【结果】构建了异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库,用P2-4从cDNA文库中杂交筛选获得了ATP6等多种互作蛋白。RNAi结果发现沉默ATP6基因后异沙叶蝉3龄若虫的WBDp传播率比对照组显著下降了23.33%±3.33%,表明ATP6是异沙叶蝉参与WBDp传播的关键蛋白。【结论】明确了异沙叶蝉ATP6是参与WBDp传播的一个关键蛋白。为进一步探明异沙叶蝉传播WBDp的分子机制和植原体病害的田间防治提供了理论基础。

关键词：异沙叶蝉小麦蓝矮植原体酵母双杂交 ATP6 RNA干扰

植原体核心基因组鉴定和小麦蓝矮植原体Imp功能鉴定

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

植原体核心基因组鉴定和小麦蓝矮植原体Imp功能鉴定

作者：王强西北农林科技大学

学位级别：硕士

在中国西北干旱半干旱地区,小麦蓝矮植原体病害是制约小麦产量的一类重要病害。目前发现小麦蓝矮植原体在田间是由条沙叶蝉进行传播。该病周期性的在西北地区发生,造成小麦严重减产。目前由于植原体无法在人工合成培养基上进行培养,因... 详细信息

在中国西北干旱半干旱地区,小麦蓝矮植原体病害是制约小麦产量的一类重要病害。目前发现小麦蓝矮植原体在田间是由条沙叶蝉进行传播。该病周期性的在西北地区发生,造成小麦严重减产。目前由于植原体无法在人工合成培养基上进行培养,因此植原体的研究受到很大的制约。当前,人们已经利用高通量测序技术获得很多植原体基因组序列。基于功能基因组学,人们对病原效应蛋白或者其它致病因子有了更进一步的探究。本实验对当前测序植原体基因组进行比较基因组学分析,鉴定一个保守的植原体核心基因组,并且找出植原体不同组之间潜在致病效应蛋白的差异。同时,初步揭示了小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白Imp的功能特点。本研究为将来植原体基因组的组装,植原体功能基因组的深入探索提供了新的借鉴。利用BioLinux平台对10个分布于5个不同组的植原体基因组进行比较基因组学的分析,结果发现这10个基因组共同含有170个保守的核心基因。有趣的是,核心基因组中并未包含保守的潜在分泌性蛋白(潜在效应因子)。这说明植原体的效应蛋白不同组之间是多样化的,其组间致病机理也可能具有差异性。在核心基因组中,占据最大比例的是一些参与基本功能的基因,像是参与转录,翻译,生物合成类的基因。另外,我们利用一种严谨的策略来挖掘组间特异性基因。结果发现大部分的组间特异性基因为推测行未知功能的蛋白,但是潜在性的分泌蛋白占据了一部分比例,这也充分说明植原体组与组之间的致病性不一致。Amp和Imp蛋白分别在16Sr XII组和16Sr III组有很大的潜在可能成为组间特异性基因,充分说明该蛋白进化较快。先前有实验证明Amp和Imp处于正向选择,并且处于正向选择中的基因很可能具有重要的功能,像是免疫,防御等功能。基于上述的实验结果,我们对小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白进行功能性的分析。基于其基因组,小麦蓝矮植原体只含有一种免疫膜蛋白,最大似然法系统进化树显示小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白聚类到Imp分支,并且从进化树上可以看出,目前发现的植原体中仅仅在16Sr XII和16Sr I中发现Amp,而这两组的一些植原体则含有Imp蛋白。少数植原体中可以同时含有这两种膜蛋白。其中在基因组上Amp相对Imp的位置是相对固定的。其中我们对小麦蓝矮植原体Imp进行了多克隆抗体的制备,对后续小麦蓝矮植原体的特异性检测奠定基础。另外,多种方法验证了小麦蓝矮植原体Imp可以与条沙叶蝉的肌动蛋白体外互作。本实验结果可以为植原体特异性传播机理的研究奠定基础。

关键词：小麦蓝矮植原体核心基因组分泌蛋白免疫膜蛋白条沙叶蝉

介体条沙叶蝉内小麦蓝矮植原体的免疫荧光标记

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

介体条沙叶蝉内小麦蓝矮植原体的免疫荧光标记

作者：张鹏辉西北农林科技大学

学位级别：硕士

小麦蓝矮病作为我国西北部地区小麦重要病害之一,严重影响小麦生产安全。小麦蓝矮病的病原是小麦蓝矮植原体,在田间小麦.蓝矮植原体.由.介体条沙叶蝉传播危害。目前对于介体条沙叶蝉内小麦蓝矮植原体分布定位与带毒量的检测,主要采用了... 详细信息

小麦蓝矮病作为我国西北部地区小麦重要病害之一,严重影响小麦生产安全。小麦蓝矮病的病原是小麦蓝矮植原体,在田间小麦.蓝矮植原体.由.介体条沙叶蝉传播危害。目前对于介体条沙叶蝉内小麦蓝矮植原体分布定位与带毒量的检测,主要采用了电子显微镜法。电子显微镜检测存在的缺点主要有:制样时间长、检测设备昂贵,;不能在组织整体水平上对小麦蓝矮植原体的定位进行观察。本实验通过利用免疫荧光标记的方法,标记到了条沙叶蝉内的小麦蓝矮植原体。该方法可以对条沙叶蝉内小麦蓝矮植原体的分布进行实时的定位观察,明确了叶蝉内的带毒部位。本实验为探索小麦蓝矮植原体在条沙叶蝉内的循回过程奠定了坚实的基础。从陕西韩城未发病小麦田块捕捉条沙叶蝉,人工养殖后,收集若虫饲养在无毒小麦上,繁殖得到无毒条沙叶蝉。把无毒条沙叶蝉转移至感染小麦蓝矮植原体的小麦病株上饲毒,在饲毒的不同时间,提取饲毒条沙叶蝉单头DNA,使用巢式PCR扩增的方法,检测饲毒条沙叶蝉的获毒率。实验结果发现条沙叶蝉饲毒7 d时,条沙叶蝉的获毒率可以达到80%以上,条沙叶蝉可用于后续荧光标记试验。提取充分获毒的条沙叶蝉总蛋白,与实验室王强师兄制备的小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白(IMP)多克隆抗体进行western blot实验。结果表明在饲毒条沙叶蝉在21Kda处有特异性条带的存在,与预测的IMP蛋白大小相吻合,而健康条沙叶蝉未出现此条带。实验结果表明制备的IMP多克隆抗体特异性良好,可以用于后续荧光标记实验。基于上述实验结果,解剖获毒7 d条沙叶蝉,进行免疫荧光标记实验。在获毒条沙叶蝉唾液腺,前,中肠均检测到清晰的绿色点状荧光,而健康条沙叶蝉未检测到绿色点状荧光的存在,表明成功定位到了获毒条沙叶蝉内的小麦蓝矮植原体,明确了叶蝉内的带毒部位。表明所建立的荧光免疫标记方法可以对条沙叶蝉内小麦蓝矮植原体的分布进行实时的检测,对小麦蓝矮植原体的分布进行直观的展示。

关键词：条沙叶蝉免疫荧光标记小麦蓝矮植原体