小麦蓝矮植原体RNA沉默抑制子的鉴定

作     者：陈文宝 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴云锋

授予年度：2018年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：小麦蓝矮植原体 RNA沉默 RNA沉默抑制子 分泌蛋白 

摘      要：RNA沉默抑制子通过抑制或者干扰寄主RNA沉默通路,提高了病原物侵染效率。到现在,研究已表明病毒、细菌和真菌均可编码RNA沉默抑制子。沉默抑制子的研究在揭示病原物与寄主互作,以及在病害防控上均有较大意义。植原体也可能也编码RNA沉默抑制子去提高自身侵染的效率。但到目前,植原体上没有RNA沉默抑制子相关的研究报道。随着小麦蓝矮基因组测序的完成,为我们鉴定提供了可能,因此我们对小麦蓝矮植原体编码的分泌蛋白进行了RNA沉默抑制活性鉴定,主要结果如下:(1)克隆了WBD 37个分泌蛋白DNA基因,分别将其成功构建到植物表达载体pBI121上,并成功转化到农杆菌GV3101中。(2)分别将构建好的37个分泌蛋白植物表达载体同pBI121-GFP共浸润4-5叶期16c本氏烟叶片,同时以浸润pBI121-GFP和pBI121空载体的本氏烟植株为阴性对照,以pBI121-P19和pBI121-GFP为阳性对照。在紫外灯下进行表型筛选,结果表明SWP16能抑制GFP诱发的系统沉默,其他蛋白在局部和系统上都没有表现出抑制活性。同时通过荧光定量和western blot分别从RNA水平和蛋白水平进行了验证,证实了SWP16的抑制子活性。(3)为了检验SWP16的抑制活性,将SWP16基因重组到PVX载体上,通过试验发现PVX-SWP16浸润本氏烟后,在10天时上部叶片和系统叶片均出现严重的花叶、卷曲等症状,而阴性对照上部叶片花叶和卷曲症状较轻。我们选取PVX病毒外壳蛋白CP基因定量分析发现:浸润了PVX-SWP16叶片的PVX-CP含量要显著高于浸润了PVX空载体的含量,约为1600倍。该结果表明SWP16不仅加重了PVX致病性而且还增加了PVX病毒的积累,是一个植物病害的加重因子。(4)在mRNA水平检测SWP16在抑制寄主沉默过程中RNA沉默通路上相关基因的表达量,包括Nb DCL1-4、Nb AGO1、Nb AGO2。在1 dpi后,RNA沉默通路中的DCL1,DCL2,DCL3,DCL4,AGO2都下调表达,因此推测SWP16可能作用于DCL,AGO合成的相关通路,并抑制RNA沉默相关基因的表达。在2 dpi后,DCL1,DCL2,DCL3,AGO2仍下调表达。在4 dpi后,全部基因都显著的上调表达,这可能由于SWP16主要不是通过抑制DCL、AGO基因表达发挥抑制活性,而是主要通过抑制沉默信号的传导发挥抑制活性。通过构建亚细胞定位表达载体PCAMBAI1302-SWP16定位了SWP16,SWP16主要分布在细胞质中,尤其集中分布在细胞膜上。另外,少量SWP16少量定位在细胞核上。构建PCAMBAI1302-SWP16,SWP16主要定位在细胞核和细胞膜上。亚细胞定位结果也证明了SWP16可能通过抑制沉默信号的系统传导发挥抑制活性。