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贵州蓝莓蜜TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立与应用

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现代食品科技 2024年第3期40卷 342-349页

作者：张致豪孙丽萍师丰丰黄家兴韦小平黑龙江省农业科学院牡丹江分院黑龙江牡丹江157000 中国农业科学院蜜蜂研究所北京100093 伊犁哈萨克自治州农业科学研究所新疆伊犁835000 贵州省农业科学院现代农业发展研究所贵州贵阳550006

该研究利用TaqMan特异性探针实时荧光PCR检测手段,建立了高效、精准鉴别贵州特色(中蜂)蓝莓蜜的方法。对贵州白竹林、麻卡和乌卡坪三个地域的蓝莓种植区蓝莓蜜进行采集(包括意蜂蓝莓蜜),同时购买市售蜂蜜及加拿大蓝莓蜜,该方法通过采集... 详细信息

该研究利用TaqMan特异性探针实时荧光PCR检测手段,建立了高效、精准鉴别贵州特色(中蜂)蓝莓蜜的方法。对贵州白竹林、麻卡和乌卡坪三个地域的蓝莓种植区蓝莓蜜进行采集(包括意蜂蓝莓蜜),同时购买市售蜂蜜及加拿大蓝莓蜜,该方法通过采集贵州麻江县白竹林地区蓝莓种植园及蜂场周围蓝莓同花期26种植物样本,基于植物基因组中trnL基因序列的多序列比对,设计蓝莓trnL基因特异性引物,并进行TaqMan探针验证。结果表明,本研究设计的TaqMan探针特异性强,建立的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法能检测到蓝莓花粉DNA最低浓度为0.3 ng/μL;利用建立的方法对11种市售蜂蜜和贵州蓝莓蜜样本进行检测,发现贵州蓝莓蜜的Ct值为24~26,蓝莓花粉数在800~1700颗,其余蜂蜜Ct值在30以上,表明该方法能够有效实现贵州蓝莓蜜和其他蜂蜜的区分,具有良好的应用前景。

关键词：蓝莓蜜实时荧光PCR TaqMan探针蜜源植物

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暗色刺参的实时荧光PCR鉴定

中国海洋大学学报（自然科学版） 2022年第12期52卷 33-43页

作者：吴姗虞惠贞沈旭芳孙超张荃陈哲尹文秀张明哲张晓峰杭州海关技术中心浙江杭州310016

暗色刺参(Isostichopus fuscus)已被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)目录。为精确辨别和有效保护该物种,作者进行了精准鉴定暗色刺参的实时荧光PCR方法的研究。在GenBank中收集暗色刺参及近似种海参的线粒体序列,使用海参... 详细信息

暗色刺参(Isostichopus fuscus)已被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)目录。为精确辨别和有效保护该物种,作者进行了精准鉴定暗色刺参的实时荧光PCR方法的研究。在GenBank中收集暗色刺参及近似种海参的线粒体序列,使用海参的线粒体基因中细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(Cytochrome oxidase subunitⅠgene,COⅠ)进行实时荧光PCR中引物和探针的设计。根据收集到的17种海参的25条COⅠ序列,设计了2组具有暗色刺参特异性的引物探针组合I-fu-1和I-fu-2;同时根据暗色刺参实物测序得到的COⅠ序列,设计了引物探针I-fu-3~I-fu-6。实时荧光PCR检测结果显示:I-fu-1、I-fu-3、I-fu-4、I-fu-6仅在目标物种中检测到阳性,I-fu-2和I-fu-5则在墨西哥刺参(Isostichopus badionotus)中也检测到阳性;对纯暗色刺参样本的灵敏度(指在一次荧光pcr反应中能够检测到暗色刺参的最低浓度)检测显示,I-fu-4优于I-fu-1、I-fu-3和I-fu-6,可达到0.0008 ng/μL,因此认为I-fu-4是最佳的引物探针组合。利用I-fu-4对混合物中暗色刺参进行检测,在同属近似种墨西哥刺参含量高达99.9%,暗色刺参含量低至0.05%的混合样品中,暗色刺参的实时荧光PCR检测也显示了强阳性结果。本研究建立的鉴定方法具有高特异性和灵敏度的特性,有助于快速、精准地鉴定暗色刺参。

关键词：暗色刺参物种鉴定实时荧光PCR 濒危物种

鱼肉制品中龙利鱼和巴沙鱼的鱼源性成分的双重实时荧光PCR快速检测法

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中国食品卫生杂志 2022年第3期34卷 539-545页

作者：李杰钱云开王建昌临沂市检验检测中心山东临沂276000 秦皇岛海关技术中心河北秦皇岛066004 石家庄海关技术中心河北石家庄050000

目的建立龙利鱼和巴沙鱼源性成分的双重实时荧光聚合酶链式反应(pcr)快速检测方法。方法根据13种龙利鱼的线粒体16S rRNA序列,设计通用引物和探针,根据巴沙鱼的线粒体cytb基因序列设计引物和探针,通过优化扩增反应体系进行双重实时荧光... 详细信息

目的建立龙利鱼和巴沙鱼源性成分的双重实时荧光聚合酶链式反应(pcr)快速检测方法。方法根据13种龙利鱼的线粒体16S rRNA序列,设计通用引物和探针,根据巴沙鱼的线粒体cytb基因序列设计引物和探针,通过优化扩增反应体系进行双重实时荧光PCR扩增,达到快速检测产物的目的。结果本方法特异性良好,龙利鱼基因组DNA灵敏度可达到10^(-3)ng,在与鲤鱼粉混合的鱼肉制品中可检测,质量分数灵敏度达到1%。巴沙鱼基因组DNA灵敏度可达到10^(-4)ng,在与龙利鱼粉、大西洋鳕鱼粉混合的鱼肉制品中均可检测,质量分数灵敏度达到0.1%,在与米粉混合的鱼肉制品中可检测,质量分数灵敏度达到0.001%。结论本方法检测特异性高、所需时间短、灵敏度高,可满足鱼肉制品中龙利鱼真伪鉴别和巴沙鱼掺假的检测要求。

关键词：龙利鱼巴沙鱼舌鳎实时荧光PCR 鱼肉制品掺假检测

基于TaqMan MGB探针的山茶叶杯菌实时荧光PCR快速检测方法

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园艺学报 2022年第3期49卷 663-670页

作者：吕燕段维军宁波检验检疫科学技术研究院浙江宁波315012 宁波中盛产品检测有限公司浙江宁波315012 宁波海关浙江宁波315012

对山茶叶杯菌(Ciborinia camelliae L.M.Kohn)及其近似种的β–微管蛋白(β-tubulin)基因序列进行了比较分析,设计了1对特异性引物和1条探针,建立了山茶叶杯菌实时荧光PCR检测方法。该方法能特异性检测山茶叶杯菌;体系最佳引物浓度、探... 详细信息

对山茶叶杯菌(Ciborinia camelliae L.M.Kohn)及其近似种的β–微管蛋白(β-tubulin)基因序列进行了比较分析,设计了1对特异性引物和1条探针,建立了山茶叶杯菌实时荧光PCR检测方法。该方法能特异性检测山茶叶杯菌;体系最佳引物浓度、探针浓度分别为0.8和0.7μmol·L^(-1);在10μL反应体系中,最低检测限可达1.0 pg;该方法可用于疑似携带山茶叶杯菌样品的检测与初筛。

关键词：山茶花腐病山茶叶杯菌 TaqMan MGB探针实时荧光PCR 快速检测

长孢轮枝菌Taq Man-MGB探针实时荧光PCR快速检测方法

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植物保护 2023年第4期49卷 224-232,255页

作者：段维军李雪莲吕燕张晓梅宁波检验检疫科学技术研究院宁波315012 宁波海关宁波315012 宁波中盛产品检测有限公司宁波315012 西宁市蔬菜技术服务中心西宁810016

长孢轮枝菌是一种在我国局部地区新近出现且危害性极大的植物病原真菌。根据长孢轮枝菌及其近似种的actin序列差异,设计并合成特异性引物和探针,建立了长孢轮枝菌的实时荧光PCR检测方法。特异性试验结果表明,该检测方法能特异性检测长... 详细信息

长孢轮枝菌是一种在我国局部地区新近出现且危害性极大的植物病原真菌。根据长孢轮枝菌及其近似种的actin序列差异,设计并合成特异性引物和探针,建立了长孢轮枝菌的实时荧光PCR检测方法。特异性试验结果表明,该检测方法能特异性检测长孢轮枝菌;灵敏度试验结果表明,最低检测限量为10μL反应体系中总DNA含量10 pg;实时荧光PCR优化反应条件为引物终浓度0.8μmol/L,探针终浓度0.8μmol/L,优化后的整个反应过程约1 h。实际样品检测结果表明,该方法可用于疑似受长孢轮枝菌侵染的萝卜样品检测与初筛。此方法快速、灵敏,检测过程完全闭管,无需pcr后续处理,为早期快速检测长孢轮枝菌提供了重要参考。

关键词：长孢轮枝菌实时荧光PCR Taq Man-MGB探针检测

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荞麦源性成分实时荧光PCR检测方法的建立

粮食与油脂 2024年第2期37卷 155-158,162页

作者：王哲贤张颖亢春雨曹丽霞檀建新赵世峰河北农业大学现代科技学院河北保定071000 河北农业大学食品科技学院河北保定071000 河北省人畜共患病原微生物分析与防控重点实验室河北保定071000 张家口市农业科学院河北张家口075000

为检测荞麦类食品及原料中的荞麦源性成分,根据荞麦品种DW-1核酸序列信息(KY945277.1)设计了荞麦品种特异性引物;以苦荞和甜荞品种基因组为模板,建立了荞麦源性成分的实时荧光PCR(qpcr)的检测方法,并对购自市场的多个粮食产品进行检测,... 详细信息

为检测荞麦类食品及原料中的荞麦源性成分,根据荞麦品种DW-1核酸序列信息(KY945277.1)设计了荞麦品种特异性引物;以苦荞和甜荞品种基因组为模板,建立了荞麦源性成分的实时荧光PCR(qpcr)的检测方法,并对购自市场的多个粮食产品进行检测,检测结果与商品标识相符方法特异性强、灵敏度高,为食品中荞麦源性成分的检测提供了新思路。

关键词：荞麦实时荧光PCR 真实性过敏原检测方法

全自动核酸提纯及实时荧光PCR系统的性能验证与评价

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医学动物防制 2024年第4期40卷 410-413页

作者：田锋党晓霞夏侯为民耿合员周林福陈程慧蒋璐蔡晓雪陈超怡史燕新疆国际旅行卫生保健中心乌鲁木齐海关口岸门诊部新疆维吾尔自治区乌鲁木齐830011 韶关海关综合技术服务中心江苏国际旅行卫生保健中心南京海关口岸门诊部浙江大学

目的评估全自动核酸提取纯化及实时荧光PCR分析系统检测新型冠状病毒核酸的性能。方法根据新型冠状病毒感染防控方案,研究购自上海生工的全自动核酸提取纯化及实时荧光PCR分析系统、2019-nCoV试剂盒、不同浓度的新型冠状病毒核酸检测标... 详细信息

目的评估全自动核酸提取纯化及实时荧光PCR分析系统检测新型冠状病毒核酸的性能。方法根据新型冠状病毒感染防控方案,研究购自上海生工的全自动核酸提取纯化及实时荧光PCR分析系统、2019-nCoV试剂盒、不同浓度的新型冠状病毒核酸检测标准品,对样品的阴阳性符合率、精密性、变异系数、最低检出限、重复性、检测时长等指标进行检测,并根据检测结果验证、评估自动核酸提取纯化及实时荧光PCR分析系统性能。结果样本的阴、阳性符合率均为100.00%,精密性阳性符合率均为100.00%,变异系数(coefficient of variation,CV)为≤5.00%,最低检出限循环阈值(cycle threshold,Ct)pcr短,可大规模适用于口岸一线。

关键词：新型冠状病毒性能验证实时荧光PCR 系统评价

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型实时荧光PCR方法的建立

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食品科技 2022年第1期47卷 330-335页

作者：王晓雯陈晶陈国培黄建飞王远洋李碧芳杨国武深圳市计量质量检测研究院广东深圳518131

目的:建立唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株(Burkholderia gladioli pv.cocovenenans)的实时荧光PCR方法。方法:根据唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病型菌株Co14的米酵菌酸生物合成基因bonM序列,用Primer Premier 6设计一对特异性引物和一... 详细信息

目的:建立唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株(Burkholderia gladioli pv.cocovenenans)的实时荧光PCR方法。方法:根据唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病型菌株Co14的米酵菌酸生物合成基因bonM序列,用Primer Premier 6设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立了实时荧光PCR反应体系。通过对5株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株及14株其他菌株进行实时荧光PCR检测,验证该方法的特异性。同时从菌液浓度和DNA浓度水平上进行研究,确定该检测方法的灵敏度。并同时采用该方法和GB 4789.29—2020,对155粉湿米粉及其原料大米进行检测,验证该方法的实用性。结果:实时荧光PCR方法特异性检测结果显示,5株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株均扩增阳性,其他菌株均扩增阴性。通过灵敏度试验,确定该方法检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株的菌液检测灵敏度为6.5×10^(2)cfu/mL,DNA检测灵敏度为4.8×10^(-4)ng/μL。实际样品的检测结果显示,采用该方法进行检测,2份湿米粉和3份大米pcr检测阳性,其余150份样品均为阴性,这与采用GB 4789.29—2020检测的结果一致,验证了该检测体系的实用性。结论:文章建立的实时荧光PCR检测方法,反应时间仅需1 h,设计的引物和探针具有较高的特异性及灵敏度,能够有效地用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株的快速筛查,这为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株的检测提供了一种简便、快速、准确的分子检测手段。

关键词：唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型实时荧光PCR TaqMan探针米酵菌酸

乌拉特肋脉野豌豆再生体系的完善及实时荧光定量pcr内参基因的筛选

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乌拉特肋脉野豌豆再生体系的完善及实时荧光定量PCR内参基因的筛选

作者：何馨内蒙古农业大学

学位级别：硕士

乌拉特肋脉野豌豆(Vicia costata Ledeb.cv.Wulata),为豆科多年生牧草,由于其对土质要求不高,以及逆境抵抗力和适应能力突出,极其适合在我国北方干旱草原及荒漠地区推广种植。本研究在实验室前期已建立的肋脉野豌豆组织培养体系的基础... 详细信息

乌拉特肋脉野豌豆(Vicia costata Ledeb.cv.Wulata),为豆科多年生牧草,由于其对土质要求不高,以及逆境抵抗力和适应能力突出,极其适合在我国北方干旱草原及荒漠地区推广种植。本研究在实验室前期已建立的肋脉野豌豆组织培养体系的基础上对生根体系进行优化,并构建肋脉野豌豆叶片原生质体制备及转化体系。同时利用实验室前期已获得的肋脉野豌豆转录组数据,初步筛选出10个候选内参基因,使用实时荧光定量pcr技术对发育成熟肋脉野豌豆的不同器官和不同胁迫处理后的材料做内参基因表达量检测,通过分析软件对其稳定性进行评估和筛选。结果如下:(1)乌拉特肋脉野豌豆生根培养体系:肋脉野豌豆诱导生根的最优培养基为1/2MS+0.5mg/L NAA,生根率为72.3%,生根平均长度3.8cm/条,生根平均粗度2.8mm/条。在生根培养基上培养30d后转移到新的生根培养基上继代培养,最后将生根植株转移到1/2MS培养基上继续培养最终获得成熟植株。(2)乌拉特肋脉野豌豆叶片原生质体制备及载体转化:以1 g成熟肋脉野豌豆植株叶片为材料,用“Tape-Arabidopsis Sandwich”法处理叶片,采用酶解法提取分离原生质体。酶解液组成为1.4%纤维素酶+0.34%离析酶+11%甘露醇+0.55%Ca Cl,p H5.8,酶解温度25℃,酶解时间6小时。乌拉特肋脉野豌豆叶片原生质体瞬时转化体系:在40%PEG4000介导下将带有GFP和RFP荧光标签的表达载体转入肋脉野豌豆叶片原生质体。(3)乌拉特肋脉野豌豆内参基因的筛选:从10个候选内参基因中筛选出Vc.EF1A和Vc.18s RNA可以作为肋脉野豌豆实时荧光PCR的内参基因。在根、茎和叶中Vc.EF1A表达稳定性最好,在干旱胁迫处理后的肋脉野豌豆中选择Vc.18s RNA作为内参基因,盐胁迫处理后的肋脉野豌豆中的内参基因选择Vc.EF1A,而低温胁迫后的肋脉野豌豆内参基因选择Vc.EF1A最佳。

关键词：乌拉特肋脉野豌豆生根体系原生质体内参基因筛选实时荧光PCR