乌拉特肋脉野豌豆再生体系的完善及实时荧光定量PCR内参基因的筛选

作     者：何馨 

作者单位：内蒙古农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：白薇

授予年度：2022年

学科分类：090503[农学-草业科学] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：乌拉特肋脉野豌豆 生根体系 原生质体 内参基因筛选 实时荧光PCR 

摘      要：乌拉特肋脉野豌豆(Vicia costata Ledeb.cv.Wulata),为豆科多年生牧草,由于其对土质要求不高,以及逆境抵抗力和适应能力突出,极其适合在我国北方干旱草原及荒漠地区推广种植。本研究在实验室前期已建立的肋脉野豌豆组织培养体系的基础上对生根体系进行优化,并构建肋脉野豌豆叶片原生质体制备及转化体系。同时利用实验室前期已获得的肋脉野豌豆转录组数据,初步筛选出10个候选内参基因,使用实时荧光定量PCR技术对发育成熟肋脉野豌豆的不同器官和不同胁迫处理后的材料做内参基因表达量检测,通过分析软件对其稳定性进行评估和筛选。结果如下:(1)乌拉特肋脉野豌豆生根培养体系:肋脉野豌豆诱导生根的最优培养基为1/2MS+0.5mg/L NAA,生根率为72.3%,生根平均长度3.8cm/条,生根平均粗度2.8mm/条。在生根培养基上培养30d后转移到新的生根培养基上继代培养,最后将生根植株转移到1/2MS培养基上继续培养最终获得成熟植株。(2)乌拉特肋脉野豌豆叶片原生质体制备及载体转化:以1 g成熟肋脉野豌豆植株叶片为材料,用“Tape-Arabidopsis Sandwich法处理叶片,采用酶解法提取分离原生质体。酶解液组成为1.4%纤维素酶+0.34%离析酶+11%甘露醇+0.55%Ca Cl,p H5.8,酶解温度25℃,酶解时间6小时。乌拉特肋脉野豌豆叶片原生质体瞬时转化体系:在40%PEG4000介导下将带有GFP和RFP荧光标签的表达载体转入肋脉野豌豆叶片原生质体。(3)乌拉特肋脉野豌豆内参基因的筛选:从10个候选内参基因中筛选出Vc.EF1A和Vc.18s RNA可以作为肋脉野豌豆实时荧光PCR的内参基因。在根、茎和叶中Vc.EF1A表达稳定性最好,在干旱胁迫处理后的肋脉野豌豆中选择Vc.18s RNA作为内参基因,盐胁迫处理后的肋脉野豌豆中的内参基因选择Vc.EF1A,而低温胁迫后的肋脉野豌豆内参基因选择Vc.EF1A最佳。