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GGC54GAC MBL突变体的构建

中国免疫学杂志 2001年第5期17卷 260-262,265页

作者：陈政良卢晓张丽芸韩强涛第一军医大学免疫学教研室广州510515

目的 :在人甘露聚糖结合凝集素 (MBL)基因中引入GGC5 4GAC点突变。方法 :设计上下游引物和诱变引物 ,以汉族人野生型MBLcDNA为模板 ,采用megaprimer PCR技术进行定点突变 ,将PCR产物克隆至pGEM T载体 ,酶切和测序分析。结果 :以上游引... 详细信息

目的 :在人甘露聚糖结合凝集素 (MBL)基因中引入GGC5 4GAC点突变。方法 :设计上下游引物和诱变引物 ,以汉族人野生型MBLcDNA为模板 ,采用megaprimer PCR技术进行定点突变 ,将PCR产物克隆至pGEM T载体 ,酶切和测序分析。结果 :以上游引物和诱变引物进行第一轮PCR ,获得一约 180bp的DNA片段 ,以此片段和下游引物行第二轮PCR扩增 ,得到一长约 780bp的产物 ;将其克隆至pGEM T载体 ,酶切发现第 5 4位密码中的BanI酶切位点已被破坏 ,与计算机酶切图谱分析结果一致 ;序列分析表明 ,除第 5 4位密码变为GAC外 ,余与野生型MBLcDNA完全相同。结论 :构建成功了GGC5 4GACMBL突变体。

关键词：甘露聚糖结合凝集素 GGC54GAC突变体定点突变 MBL

HBV基因T1862突变真核表达载体的构建及在Cos7细胞中的表达

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第一军医大学学报 2001年第4期21卷 255-257页

作者：林裕龙侯金林王战会阎丽周福元骆抗先第一军医大学南方医院感染内科广东广州510515

目的研究ＨＢＶＴ１８６２变异的生物学意义。方法采用分子生物学方法，构建ＨＢＶ前Ｃ／Ｃ基因ＥＢ病毒真核表达载体，利用体外定点突变技术诱导前Ｃ／Ｃ基因Ｔ１８６２变异，经ＰＣＲ－ＲＦＬＰ初筛并经测序终鉴定出阳性克隆后，... 详细信息

目的研究ＨＢＶＴ１８６２变异的生物学意义。方法采用分子生物学方法，构建ＨＢＶ前Ｃ／Ｃ基因ＥＢ病毒真核表达载体，利用体外定点突变技术诱导前Ｃ／Ｃ基因Ｔ１８６２变异，经ＰＣＲ－ＲＦＬＰ初筛并经测序终鉴定出阳性克隆后，以脂质体介导方法将突变前后的重组质粒转染Ｃos７细胞，以ＥＬＩＳＡ检测ＨＢeＡg的表达量。结果未突变的重组质粒可稳定表达ＨＢｅＡｇ，突变后的重组质粒未能检测到ＨＢｅＡｇ表达。结论ＨＢＶ前Ｃ／Ｃ基因１８６２点突变的真核表达载体的构建，为体外研究该点突变引起ＨＢＶ的一系列生物学改变奠定基础。

关键词：真核表达载体定点突变基因转染乙型肝炎病毒 HBV Cos7细胞

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封面故事

生物物理学报 2010年第4期26卷 I0001-I0001页

氮氧自由基定点标记结合顺磁共振技术探测蛋白质等生物大分子的结构信息，是目前结构生物学研究中的一项新兴技术。通过基因的定点突变以及修饰反应，可将蛋白质特定空间位置上的氨基酸残基替换成含有氮氧自由基的非天然残基（简称为R1... 详细信息

氮氧自由基定点标记结合顺磁共振技术探测蛋白质等生物大分子的结构信息，是目前结构生物学研究中的一项新兴技术。通过基因的定点突变以及修饰反应，可将蛋白质特定空间位置上的氨基酸残基替换成含有氮氧自由基的非天然残基（简称为R1）。随后收集并分析R1产生的顺磁共振谱的线型，计算出该位点上R1的运动性、极性、接触性以及偶极。偶极作用等参数，

关键词：磁共振技术氮氧自由基氨基酸残基故事封面定点突变偶极作用生物大分子

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什么是miRNA及其作用?

中华检验医学杂志 2007年第11期30卷 1307-1307页

作者：董矜

答：micro RNAs（miRNAs）是一类长约22核苷酸的非编码的单链RNA分子，5＇端带磷酸基团、3＇端带羟基的非蛋白编码的调控小RNA家族。它们广泛存在于从植物、线虫到人类的细胞中。1993年，Lee等人用经典的定位克隆的方法在线虫（***）中... 详细信息

答：micro RNAs（miRNAs）是一类长约22核苷酸的非编码的单链RNA分子，5＇端带磷酸基团、3＇端带羟基的非蛋白编码的调控小RNA家族。它们广泛存在于从植物、线虫到人类的细胞中。1993年，Lee等人用经典的定位克隆的方法在线虫（***）中克隆了lin-4基因，并通过定点突变发现lin-4并不编码蛋白，而是产生一种小RNA分子（miRNA）。这种小RNA分子能以不完全互补的方式与其靶mRNA的3＇非翻译端的特定区域相互作用来抑制lin—14的表达，

关键词： miRNA RNA分子蛋白编码定位克隆 micro 磷酸基团编码蛋白定点突变

硫氧还原蛋白突变基因用于鲑鱼降钙素的高效可溶性融合表达

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基础医学与临床 2001年第1期21卷 24-27页

作者：刘深基陈松森狄旭熊安琪张友鸿中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所北京100005

为了化学裂解后重组多肽的分离纯化 ,用双引物定点突变的方法将表达质粒pTrx sCT Gly中硫氧还原蛋白 (Trx)与鲑鱼降钙素 (sCT)的融合基因的第 38位Met突变为Ala,并将突变后的基因克隆到pET30a中 ,然后转入大肠杆菌BL2 1,以IPTG诱导 ,使... 详细信息

为了化学裂解后重组多肽的分离纯化 ,用双引物定点突变的方法将表达质粒pTrx sCT Gly中硫氧还原蛋白 (Trx)与鲑鱼降钙素 (sCT)的融合基因的第 38位Met突变为Ala,并将突变后的基因克隆到pET30a中 ,然后转入大肠杆菌BL2 1,以IPTG诱导 ,使降钙素与硫氧还原蛋白融合表达 ,融合蛋白占菌体总蛋白的 5 6 %左右。并发现本原核表达体系存在“表达渗漏”现象 ,此现象为在菌体的对数生长期中 ,外源蛋白极少表达 ,随着培养时间的延长 ,外源蛋白逐步积累 ,达到 5 1%的高水平。该发现在基因工程生产重组蛋白工艺中具有应用价值。

关键词：鲑鱼降钙素定点突变高效表达硫氧还原蛋白

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青霉素G酰化酶操纵子的负调控因子的研究

生物工程学报 1998年第3期14卷 281-286页

作者：王宇澄蒋岚杨胜利中国科学院上海生物工程研究中心

青霉素Ｇ酰化酶（ＰＡ）操纵子的调节基因（ｐａｃＲ）存在于青霉素Ｇ酰化酶结构基因（ｐａｃ）内部Ｄｒａ１Ｔａｑ１一段约５００ｂｐ的ＤＮＡ片段内，此片段内含有２个ＯＲＦ。２个ＯＲＦ及其突变体分别克隆到ｐＵＣ１８得到一系列... 详细信息

青霉素Ｇ酰化酶（ＰＡ）操纵子的调节基因（ｐａｃＲ）存在于青霉素Ｇ酰化酶结构基因（ｐａｃ）内部Ｄｒａ１Ｔａｑ１一段约５００ｂｐ的ＤＮＡ片段内，此片段内含有２个ＯＲＦ。２个ＯＲＦ及其突变体分别克隆到ｐＵＣ１８得到一系列重组质粒，用这些重组质粒转化青霉素Ｇ酰化酶产生菌Ｅ．ｃｏｌｉＤ８１６，测定克隆片段对ＰＡ表达的影响。如果克隆片段含有具功能的ｐａｃＲ，诱导剂苯乙酸（ＰＡＡ）不能使由高拷贝ｐａｃＲ表达的阻抑物全部失活，部分阻抑物结合ｐａｃ操纵基因，阻碍ＲＮＡ聚合酶对ｐａｃ的转录，因此ＰＡ的表达量降低。结果表明，阻抑物是由ｐａｃ结构基因内部的ＯＲＦ２编码的蛋白因子，ｐａｃＲ即ＯＲＦ２。ＲＮＡＤＮＡ杂交实验证实了ｐａｃＲ在转录水平阻抑ｐａｃ的表达。

关键词：青霉素G酰化酶调节基因定点突变操纵子

环糊精葡萄糖基转移酶使用性能改善的关键技术研究

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食品与生物技术学报 2015年第8期34卷 896-896页

作者：张群江南大学图书馆

目前,环糊精的工业化生产采用酶法工艺,即淀粉在环糊精葡萄糖基转移酶（EC 3.***.1.19,简称CGT酶）作用下通过环化反应合成环糊精。CGT酶生产环糊精最不利的条件之一是产物特异性差,这使产物的分离纯化很不方便。同时,CGT酶的另一缺陷是... 详细信息

目前,环糊精的工业化生产采用酶法工艺,即淀粉在环糊精葡萄糖基转移酶（EC 3.***.1.19,简称CGT酶）作用下通过环化反应合成环糊精。CGT酶生产环糊精最不利的条件之一是产物特异性差,这使产物的分离纯化很不方便。同时,CGT酶的另一缺陷是其热稳定性较差。由于在环糊精工业化生产中,底物淀粉首先要经过高温糊化、液化处理,然后降温至适当温度进行环化反应,

关键词：葡萄糖基转移酶环化反应使用性能酶法分离纯化定点突变野生型突变体钙离子结合位点特异性

HBV信号肽区热点变异真核表达载体的构建及对HBeAg表达的影响

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解放军医学杂志 2001年第7期26卷 480-482页

作者：林裕龙侯金林王战会孙剑阎丽骆抗先第一军医大学南方医院广州510515

采用分子生物学方法 ,设计引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增HBV的Pre C/C片段 (1814～ 2 45 2 ) ,经酶切后连于EBO真核表达载体 ,利用定点突变技术分别对连接载体进行T186 2 ,A1896 ,A1899,A1896 +A1899点的定点诱变。经错配PCR RFL... 详细信息

采用分子生物学方法 ,设计引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增HBV的Pre C/C片段 (1814～ 2 45 2 ) ,经酶切后连于EBO真核表达载体 ,利用定点突变技术分别对连接载体进行T186 2 ,A1896 ,A1899,A1896 +A1899点的定点诱变。经错配PCR RFLP和测序分析 ,确定突变的克隆。将突变前后的质粒以脂质体转染法转染HepG2细胞 ,检测不同点突变后HBeAg表达的改变。突变前后的质粒转染HepG2细胞经稳定表达 ,结果未突变的EBO PreC/C重组质粒HBeAg表达为强阳性 ,A1899突变的重组质粒HBeAg表达比未突变的重组质粒稍弱 ,而转染EBO空载体和T186 2 ,A1896 ,A1896 +A1899重组质粒突变体的细胞培养上清HBeAg均为阴性。

关键词：定点突变真核表达载体基因转染乙型肝炎 HBV 前C信号肽区热点变异

黄瓜花叶病毒互补型载体可与CP转基因发生重组

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中国科学（C辑） 2001年第2期31卷 97-105页

作者：雷万里方荣祥张国华陈晓英张晓勤中国科学院微生物研究所北京100080

为了探讨利用黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）作为表达载体的可行性，克隆了山东株（ＳＤ）ＣＭＶ　ＲＮＡ３的全长ｃＤＮＡ，并测定了全序列．采用定点突变的方法在衣壳蛋白（ＣＰ）基因起始密码子处改造出一个ＮｓｉＩ位点．以绿色荧光蛋白（... 详细信息

为了探讨利用黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）作为表达载体的可行性，克隆了山东株（ＳＤ）ＣＭＶ　ＲＮＡ３的全长ｃＤＮＡ，并测定了全序列．采用定点突变的方法在衣壳蛋白（ＣＰ）基因起始密码子处改造出一个ＮｓｉＩ位点．以绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因置换ＳＤ－ＣＭＶＲＮＡ３ｃＤＮＡ的ＣＰ基因．将Ｆｎｙ株ＣＭＶＲＮＡｌ，ＲＮＡ２和嵌合ＳＤ－ＣＭＶＲＮＡ３的ｃＤＮＡ分别克隆在３５Ｓ启动子和终止子之间构建成表达载体．在烟草原生质体中验证了该表达载体可以表达ＧＦＰ．然后将其接种到表达ＳＤＣＰ的转基因烟草上，试图构建成一个互补型载体．接种１０ｄ后，１８棵植株中，有５棵的接种叶和其中１棵的系统叶上可检测到表达的ＧＦＰ．然而１个月后，所有接种植株中都检测不到ＧＦＰ．通过ＲＴ－ＰＣＲ及序列分析，证实在互补系统中ＣＭＶ载体与ＣＰ转基因发生了重组．上述结果对这种ＣＭＶ互补型载体的可行性提出了质疑，同时也揭示了转ＣＭＶＣＰ基因抗病毒植物的生物安全性中存在的新的问题．

关键词：黄瓜花叶病毒互补型载体 CP转基因重组生物安全性定点突变绿色荧光蛋白基因