检索结果-南通市图书馆

定点突变提高海洋氧化节杆菌KQ11右旋糖酐酶的催化活性

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生物工程学报 2024年

作者：夏冰冰马岱叶子凡杨静文张洪斌胡雪芹合肥工业大学食品与生物工程学院

右旋糖酐酶是一种专一性水解α-1，6糖苷键的酶。本文针对海洋氧化节杆菌(Arthrobacter oxidans) KQ11来源的右旋糖酐酶，采用定点突变方法对参与“隧道状结合位点”的氨基酸进行改造，并在此基础上对507位进行了饱和突变，获得了酶活... 详细信息

右旋糖酐酶是一种专一性水解α-1，6糖苷键的酶。本文针对海洋氧化节杆菌(Arthrobacter oxidans) KQ11来源的右旋糖酐酶，采用定点突变方法对参与“隧道状结合位点”的氨基酸进行改造，并在此基础上对507位进行了饱和突变，获得了酶活和催化效率提高的突变酶A356G、S357W、W507Y、W507F。与野生株(wild type， WT)相比，突变体W507Y的比活力提高了2倍，kcat提高了3.62倍，Km下降了54%，催化效率kcat/Km提高了8.98倍。三维结构分析表明，相比于WT突变体W507Y与“隧道状结合位点”的另一侧氨基酸间的距离缩短，更易产生氢键作用力，因此加快了底物的水解和产物排出，使得酶活和催化效率大幅提高。

关键词：右旋糖酐酶定点突变比活力底物通道

定点突变改造谷胱甘肽合成相关酶及高效催化生产谷胱甘肽

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食品与发酵工业 2024年

作者：张秀春王骏之徐华栋沈美华南京工业大学生物与制药工程学院常州大学药学院生物与食品工程学院

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一种含有γ-酰胺键和巯基的三肽化合物，广泛应用于医药、食品和化妆品等领域。谷胱甘肽的生物合成主要由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，GSHA）和谷胱甘肽合成酶（glutathio... 详细信息

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一种含有γ-酰胺键和巯基的三肽化合物，广泛应用于医药、食品和化妆品等领域。谷胱甘肽的生物合成主要由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，GSHA）和谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GSHB）两步催化得到。在利用天然酶催化生产谷胱甘肽的过程中，发现天然酶的催化效果较差，其中GSHA为反应过程中的限速酶，该酶会受到产物的反馈抑制。该文对来自大肠杆菌（Escherichia coli）的GSHA进行分子改造，对GSHA中参与转化的活性位点进行分析，通过丙氨酸扫描对关键氨基酸进行替换。对蛋白质表面非活性区域的氨基酸进行分析，引入带负电荷的氨基酸提高稳定性。将酶活提升的突变位点进行组合，获得了催化效果较高的突变体Y131A-A511D，相比于野生型酶活提高了6倍，并对最佳突变体的酶学性质进行分析。将突变体Y131A-A511D用于催化合成谷胱甘肽，在8 h内合成了76.8 mmol/L的谷胱甘肽，达到了高效催化生产谷胱甘肽的目的。

关键词：谷胱甘肽 γ-谷氨酸半胱氨酸连接酶定点突变丙氨酸扫描酶催化

定点突变引入离子键提高植酸酶YiAPPA热稳定性的研究

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食品工业科技 2024年

作者：曾静郭建军王通袁林江西省科学院微生物研究所

本研究旨在通过定点突变引入离子键来提高植酸酶YiAPPA的热稳定性。对比YiAPPA与热稳定性优良的植酸酶rPhyXT52的分子结构，采用定点突变技术向YiAPPA中引入与rPhyXT52热稳定性相关的分子表面离子键，构建离子键突变体。通过热稳定性筛... 详细信息

本研究旨在通过定点突变引入离子键来提高植酸酶YiAPPA的热稳定性。对比YiAPPA与热稳定性优良的植酸酶rPhyXT52的分子结构，采用定点突变技术向YiAPPA中引入与rPhyXT52热稳定性相关的分子表面离子键，构建离子键突变体。通过热稳定性筛选，获得热稳定性显著提高的离子键突变体T209K/S220E/N237D。突变体T209K/S220E/N237D的酶学特性研究结果表明：突变体T209K/S220E/N237D于37 ℃、pH 4.5的绝对酶活为3982.06 U/mg，与YiAPPA基本一致；T209K/S220E/N237D的最适反应温度、最适反应pH、pH稳定性以及蛋白酶抗性也与YiAPPA基本一致；与YiAPPA相比，T209K/S220E/N237D于80 ℃半衰期由14.81 min延长至24.72min，半失活温度T5030由55.12 ℃提升至64.05 ℃，Tm值由48.36 ℃提升至55.04 ℃。分子动力学模拟显示：T209K/S220E/N237D中引入了新的离子键，提高了酶分子中构成这些离子键的氨基酸残基所在的结构单元的稳定性，从而提高了酶的热稳定性。本研究结果表明，向YiAPPA中引入离子键可有效提高其热稳定性，使其更适用于食品加工领域。本研究也可为植酸酶以及其他类型酶的热稳定性改造提供理论依据。

关键词：植酸酶定点突变离子键热稳定性分子动力学模拟

暗紫贝母甲羟戊酸激酶基因的重组表达与定点突变研究

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华西药学杂志 2024年第1期39卷 48-52页

作者：黄德娅邹萌黄斌翰周嘉裕廖海西南交通大学生命科学与工程学院四川成都610000

目的研究暗紫贝母Fritillaria unibracteata甲羟戊酸激酶(FUMK)基因的重组表达与定点突变。方法基于暗紫贝母转录组中FUMK基因的ORF序列,全化学合成FUMK-pET28a重组质粒,在大肠杆菌BL21中表达其重组蛋白,纯化后检测其酶活性。利用定点... 详细信息

目的研究暗紫贝母Fritillaria unibracteata甲羟戊酸激酶(FUMK)基因的重组表达与定点突变。方法基于暗紫贝母转录组中FUMK基因的ORF序列,全化学合成FUMK-pET28a重组质粒,在大肠杆菌BL21中表达其重组蛋白,纯化后检测其酶活性。利用定点突变验证关键氨基酸。结果FUMK基因ORF全长为1158 bp,编码一条长度为385个氨基酸的多肽。FUMK与卷叶贝母的甲羟戊酸激酶(MK)同源性最高,序列相似性可达77.14%。FUMK与百合科贝母属植物的MK聚类形成单系群,具有最近的亲缘关系。在大肠杆菌BL21中成功表达出FUMK重组蛋白,纯化后的重组蛋白能够催化腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)与甲羟戊酸反应,形成甲羟戊酸磷酸。FUMK对ATP的酶促反应最大速度(Vmax)与米氏常数(Km)值分别为1.72μmol·min^(-1)·mg^(-1)、15.84μmol·L^(-1);对甲羟戊酸的Vmax与Km值分别为0.71μmol·min^(-1)·mg-1、28.58μmol·L^(-1)。His198Ala和Ser137Ala两种突变蛋白的酶促活性分别显著减少49.08%、23.91%,表明其是FUMK行使催化功能的关键氨基酸残基。结论成功鉴定了FUMK基因,并验证了His198与Ser137两个关键氨基酸残基,为研究其基因在暗紫贝母甾体类生物碱生物合成途径中的生物学作用奠定了理论基础。

关键词：暗紫贝母甲羟戊酸激酶生物信息学分析重组表达定点突变序列比对催化反应反应速率

基于分子对接和定点突变的红花糖基转移酶催化机理研究

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中药与临床 2024年第1期15卷 1-8,14页

作者：奚子晴韩馨雨任超翔陈江裴瑾成都中医药大学药学院四川成都611137 西南特色中药资源国家重点实验室成都中医药大学四川成都611137

目的:基于分子对接和定点突变制备蛋白突变体,用UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS分析酶产物变化,推测红花糖基转移酶CtUGT12的催化机理。方法:本研究发现了一种对木犀草素具有较高催化活性的红花类黄酮糖基转移酶CtUGT12。通过AlphaFold预... 详细信息

目的:基于分子对接和定点突变制备蛋白突变体,用UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS分析酶产物变化,推测红花糖基转移酶CtUGT12的催化机理。方法:本研究发现了一种对木犀草素具有较高催化活性的红花类黄酮糖基转移酶CtUGT12。通过AlphaFold预测CtUGT12蛋白结构,用Autodock软件将CtUGT12分别与木犀草素以及尿苷二磷酸葡萄糖二钠盐进行分子对接,寻找到酶反应的关键活性位点进行定点突变。用蛋白突变体进行体外酶反应实验,通过高分辨质谱仪进行检测,推测CtUGT12催化机理。结果:本研究根据分子对接结果成功筛选了5个活性位点,设计并制备了8个CtUGT12蛋白突变体。利用突变蛋白进行体外酶反应实验并进行检测,质谱分析结果显示,CtUGT12可以催化木犀草素生成2个单-O-葡萄糖苷和2个二-O-葡萄糖苷。I127V、I127M、I443G、I443A、D444E活性差异不明显,F147S活性明显增强。E328R和E328M这2个突变体活性降低,但均生成了1个新的单-O-葡萄糖苷和1个新的双-O-葡萄糖苷,并且主产物发生了变化。结论:残基GLU328的突变能使CtUGT12的活性和产物组成发生明显改变,说明残基GLU328可能为CtUGT12参与木犀草素糖基化反应的关键活性位点。

关键词：红花糖基转移酶分子对接定点突变催化机理

多片段酶切/连接反应结合同源重组的DNA组装方法

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生物工程学报 2024年第5期40卷 1559-1570页

作者：饶欣悦崇金阳贺诚毕莹莹唐刚敏吕育财龚大春杨潇三峡大学生物与制药学院中国轻工业功能酵母重点实验室湖北宜昌443002 三峡大学生物与制药学院湖北省生物酵素工程技术研究中心湖北宜昌443002

为了寻找一种准确高效的多片段组装及多点突变方案,将目前常用的多片段组装方法进行了整合与优化,并以果糖-1,6-二磷酸酶1(fructose-1,6-diphosphatase 1,FBP1)基因4位点突变为例进行验证。通过引入突变位点和Bsa I识别序列连接含有突... 详细信息

为了寻找一种准确高效的多片段组装及多点突变方案,将目前常用的多片段组装方法进行了整合与优化,并以果糖-1,6-二磷酸酶1(fructose-1,6-diphosphatase 1,FBP1)基因4位点突变为例进行验证。通过引入突变位点和Bsa I识别序列连接含有突变位点的片段,经过酶切/连接反应后扩增组装成功的目的片段,并引入与线性化载体两端同源的序列,最后进行片段与线性化载体的重组并转化大肠杆菌。经筛选与测序,得到4位点突变重组质粒。该方案弥补了常规的Gibson组装和Golden Gate组装的部分缺点,是一种高效进行多片段组装和多点突变的实验方案。

关键词：定点突变多片段组装 ⅡS限制性内切酶同源重组克隆

环糊精葡萄糖基转移酶的分子改造及其在合成α-熊果苷中的应用

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生物工程学报 2024年第6期40卷 1845-1855页

作者：刘嘉琦谭明董钧刘以银刘珊娜吴洽庆天津农学院食品科学与生物工程学院天津300392 中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308

熊果苷在化妆品和医药领域具有重要应用价值,但从植物组织中提取产率低,极大地限制了其应用。本研究利用戈特沙尔克厌氧分支杆菌(Anaerobranca gottschalkii)来源的环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase),以... 详细信息

熊果苷在化妆品和医药领域具有重要应用价值,但从植物组织中提取产率低,极大地限制了其应用。本研究利用戈特沙尔克厌氧分支杆菌(Anaerobranca gottschalkii)来源的环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase),以麦芽糊精为供体,对苯二酚为受体,催化合成α-熊果苷。通过定点饱和突变和定点突变筛选到突变体Ag CGTase-F235G-N166H,活力是野生型的3.48倍。通过优化反应pH、温度、对苯二酚添加量,转化率在最优反应条件下达到63%。综上所述,本研究成功构建了一株能高效合成α-熊果苷并具有较高苯二酚转化率的菌株,对于降低α-熊果苷工业化的生产成本,提高产物的转化率方面具有重要的应用潜力。

关键词：环糊精葡萄糖基转移酶 α-熊果苷定点突变麦芽糊精对苯二酚

基于Bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略

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中国农业科学 2024年第1期57卷 96-125页

作者：徐重新金嘉凤孙晓明沈成张霄陈澄宇刘贤金刘媛江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所/省部共建国家重点实验室培育基地-江苏省食品质量安全重点实验室江苏大学食品与生物工程学院南京农业大学植物保护学院

Bt毒素是源于苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的具有特殊杀虫功能的大分子蛋白，其制剂和转基因作物已广泛用于害虫防治，产生了巨大的经济和社会生态效益。围绕Bt毒素挖掘和提升其应用价值是持续研究的热点，特别是随着Bt毒... 详细信息

Bt毒素是源于苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的具有特殊杀虫功能的大分子蛋白，其制剂和转基因作物已广泛用于害虫防治，产生了巨大的经济和社会生态效益。围绕Bt毒素挖掘和提升其应用价值是持续研究的热点，特别是随着Bt毒素结构功能和作用机制日趋明晰，为其功能修饰和创新应用创造了条件，相关研究蓬勃发展，成效显著。大量研究表明，采用定点突变、结构域替换或融合以及抗独特型抗体模拟等策略，是理性设计活性更高、稳定性更强、杀虫谱更广、非靶标生物安全性更高甚至是可用于害虫抗药性治理的有别于母体Bt毒素的突变体、结构杂合体乃至功能效应物抗体等新型杀虫蛋白的有效手段；此外，采用催化毒素活化、驱动毒素靶向受体结合、促进毒素表达以及同源或异源杀虫材料复配或共表达的协同促效等创新增效策略，也是助推Bt毒素应用价值的重要手段。本文总结了Bt毒素结构功能和作用机制，梳理了基于Bt毒素功能修饰的突变体、结构杂合体以及功能效应物抗体等新型杀虫蛋白理性设计和基于Bt毒素功能增效的创新应用策略等相关研究进展，并结合作者团队在模拟Bt毒素杀虫功能效应物抗体靶向设计研发方面的最新成果，探讨了基于Bt毒素的杀虫蛋白理性设计与创新应用策略未来发展动向及潜在可行捷径，为相关研究提供较为全面的最新有价值的文献资料和启发思路。

关键词： Bt毒素苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白定点突变抗独特型抗体蛋白融合表达杀虫增效物

乳腺癌核仁磷蛋白乙酰化及其修饰位点突变体的构建和表达

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解剖学报 2024年第2期55卷 196-202页

作者：郝经伟潘婷李月朱文斌段文博刘立琨岳丽玲刘云龙高秀丽齐齐哈尔医学院医学技术学院黑龙江齐齐哈尔161006 齐齐哈尔医学院药学院黑龙江齐齐哈尔161006 齐齐哈尔医学院医药科学研究院肿瘤分子生物学研究室黑龙江齐齐哈尔161006 齐齐哈尔医学院附属第二医院肿瘤外科黑龙江齐齐哈尔161006

目的明确女性乳腺癌中核仁磷蛋白(NPM)乙酰化修饰水平,并通过修饰位点突变体的构建探讨其功能。方法蛋白质修饰组学方法检测对比人乳腺癌组织及癌旁正常组织(各3例)NPM乙酰化水平及乙酰化位点;基因定点突变PCR构建NPM乙酰化突变体,限制... 详细信息

目的明确女性乳腺癌中核仁磷蛋白(NPM)乙酰化修饰水平,并通过修饰位点突变体的构建探讨其功能。方法蛋白质修饰组学方法检测对比人乳腺癌组织及癌旁正常组织(各3例)NPM乙酰化水平及乙酰化位点;基因定点突变PCR构建NPM乙酰化突变体,限制性内切酶(DpnI)消化及大肠埃希菌转化获得特异性突变体重组质粒;双酶切与测序验证各突变体序列准确性;瞬时转染及RT-PCR方法检测各突变体过表达效果。Western blotting验证NPM乙酰化水平,蛋白质定量组学及生物信息学分析NPM乙酰化功能。结果乳腺癌组织样本中NPM第27及第32位赖氨酸乙酰化水平分别为癌旁正常组织的2.76及2.22倍;构建的NPM乙酰化位点突变体与野生型NPM分子量一致且出现预期突变位点;转染NPM各突变体的BT-549细胞相应NPM mRNA表达水平明显升高。随着野生型NPM表达水平增加,蛋白乙酰化水平增加,27位赖氨酸发生负向突变后,修饰水平下降。NPM乙酰化可使BT-549细胞中101种蛋白表达水平发生明显变化,上述蛋白在细胞大分子生物合成,以DNA为模板的转录过程,RNA生物合成以及RNA代谢过程中富集。结论乳腺癌NPM呈高乙酰化水平并可能在细胞大分子生物合成,转录过程,RNA生物合成以及RNA代谢过程中发挥关键功能。

关键词：乳腺癌核仁磷蛋白乙酰化定点突变蛋白质组学人