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奶山羊乳腺上皮细胞及耳尖成纤维细胞转人凝血因子Ⅸ基因的研究

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奶山羊乳腺上皮细胞及耳尖成纤维细胞转人凝血因子Ⅸ基因的研究

作者：张娜内蒙古大学

学位级别：硕士

在哺乳动物转基因研究中,乳腺生物反应器因其具有产量高、易收集、表达产物不进入动物体循环系统等优点,被用于制备蛋白的研究,部分乳腺生物反应器已经进入商业化生产阶段。如何进一步提高乳腺生物反应器的表达效率和表达产物活性成为... 详细信息

在哺乳动物转基因研究中,乳腺生物反应器因其具有产量高、易收集、表达产物不进入动物体循环系统等优点,被用于制备蛋白的研究,部分乳腺生物反应器已经进入商业化生产阶段。如何进一步提高乳腺生物反应器的表达效率和表达产物活性成为了人们研究的重点。本实验选用具有新霉素抗性基因neorr表达框架的Plasmid GFP-PGK-Neor质粒为骨架,构建了14kb的乳腺组织特异性表达人凝血因子Ⅸ(hFIX)的同源打靶载体。通过PCR方法分别扩增奶山羊β—酪蛋白基因5’同源臂,人凝血因子Ⅸ基因,bGH PolyA序列,奶山羊β—酪蛋白基因3’及3’同源臂,并顺序定向克隆于真核表达质粒Plasmid GFP-PGK-Neor的多克隆位点。成功构建以奶山羊β—酪蛋白基因上下游为同源臂,由奶山羊β-casein基因5’端上游序列调控hFIX基因转录,bGH polyA序列为转录终止信号的组织特异性表达载体。经限制性酶切片段分析及DNA序列测序验证,结果表明,所构建载体结构正确。将构建的表达载体通过电转染法导入奶山羊成纤维细胞和奶山羊乳腺上皮细胞,经G418筛选后获得稳定的转基因细胞,提取细胞基因组DNA进行PCR鉴定,确定所转染的奶山羊成纤维细胞和乳腺上皮细胞内含有转入目的基因的阳性细胞。本实验所获得的转基因细胞为进一步在细胞水平检测外源基因的表达,及为通过体细胞核移植方法获得乳腺特异性表达人凝血因子Ⅸ的转基因羊奠定了实验基础。

关键词：人凝血因子Ⅸ 乳腺特异性表达载体奶山羊乳腺上皮细胞奶山羊成纤维细胞电转染

漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞乳成分合成的影响

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饲料工业 2020年第4期41卷 24-28页

作者：刘莉莉杨炳友黑龙江中医药大学药学院

以体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞为模型,利用β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖/半乳糖检测试剂盒测定漏芦乙醇提取物处理的乳腺上皮细胞培养液中β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖含量;采用荧光定量RT-PCR检测β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖合成代谢相关... 详细信息

以体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞为模型,利用β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖/半乳糖检测试剂盒测定漏芦乙醇提取物处理的乳腺上皮细胞培养液中β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖含量;采用荧光定量RT-PCR检测β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖合成代谢相关酶和蛋白因子mRNA表达的变化。结果显示,25、50、100μg/ml的漏芦乙醇提取物以浓度依赖的方式显著提高乳腺上皮细胞合成分泌β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖含量(P乳腺上皮细胞中乳成分合成代谢相关酶和蛋白因子的mRNA表达水平(P奶山羊乳腺上皮细胞合成分泌β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖,并能提高乳腺上皮细胞乳成分合成代谢相关酶和蛋白因子的基因表达,进而影响奶山羊乳腺上皮细胞乳蛋白、乳脂和乳糖的合成。

关键词：漏芦乙醇提取物奶山羊乳腺上皮细胞乳糖 β-酪蛋白甘油三酯

CREB基因在奶山羊乳腺上皮细胞乳脂代谢中的功能研究

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CREB基因在奶山羊乳腺上皮细胞乳脂代谢中的功能研究

作者：马静南开大学

学位级别：硕士

羊乳营养均衡,富含乳脂和不饱和脂肪酸。这些营养成分在医疗保健方面具有显著疗效,其含量很大程度上取决于动物的日粮结构等外部条件。然而,我国山羊饲养规模与管理方式均处于较低水平,已成为限制提高山羊生产性能及乳品质的主要瓶颈。... 详细信息

羊乳营养均衡,富含乳脂和不饱和脂肪酸。这些营养成分在医疗保健方面具有显著疗效,其含量很大程度上取决于动物的日粮结构等外部条件。然而,我国山羊饲养规模与管理方式均处于较低水平,已成为限制提高山羊生产性能及乳品质的主要瓶颈。近年来,利用分子生物学手段提高羊乳中有益脂肪酸的含量成为现代山羊育种的重要途径,但目前对羊乳中脂肪酸代谢的调控机理尚未明确。c AMP应答元件结合蛋白（CREB）是一类重要的核蛋白,可通过自身磷酸化和去磷酸化,激活调控脂代谢相关靶基因的转录活性,从而调控哺乳动物组织及器官内脂代谢相关过程。目前,该基因在反刍动物的乳脂代谢中鲜有研究。本研究通过克隆奶山羊乳腺组织中CREB基因的CDS区,构建靶向该基因的腺病毒过表达载体和靶向干扰该基因的si RNA,并检测乳脂代谢相关基因表达水平、细胞内总甘油三脂含量、不饱和脂肪酸含量及去饱和指数,为进一步揭示该基因在山羊乳腺上皮细胞乳脂代谢中的功能,提高山羊乳品质奠定理论基础。主要研究结果如下:1、首次从山羊乳腺组织中克隆到全长为984 bp的CREB基因CDS区（Gen Bank登录号:MK158073.1）,与牛、人和鼠的序列相似度分别为98%、95%和95%,氨基酸序列相似性均在95%以上。且C端b ZIP区域高度保守。2、采用RT-q PCR方法,检测CREB基因在山羊乳腺组织不同泌乳时期表达水平结果表明:该基因在泌乳盛期乳腺组织中的表达量显著高于干奶期（P＜0.05）。3、构建CREB基因腺病毒过表达载体,并将其感染奶山羊乳腺上皮细胞。结果表明:与对照组相比,过表达CREB显著上调细胞中脂代谢相关基因SREBF1、FASN、ACACA、LPL、FABP3、ACOX1、CPT1B、ATGL和DGAT1基因的m RNA水平（P＜0.05）,并显著上调细胞内Total C16:1和cis-9 C18:1含量及去饱和指数（P＜0.05）,细胞内TAG含量显著增加（P＜0.05）。4、设计合成靶向CREB基因的si RNA序列,并将其转染至奶山羊乳腺上皮细胞。结果表明:与对照组结果相比,干扰CREB基因显著降低FASN、ACACA、SCD1、LPL、FABP3、CPT1B、DGAT1和GPAM基因的表达量（P＜0.05）。同时,干扰CREB基因显著下调了细胞内TAG含量（P＜0.05）,而对Total C16:1和cis-9 C18:1含量及去饱和指数没有显著影响。综上所述,本研究成功克隆到奶山羊CREB基因的CDS区。在奶山羊乳腺上皮细胞中,CREB基因能够促进脂代谢相关基因的转录水平,影响细胞内MUFA含量及TAG含量,本研究为该基因的在乳脂代谢中的功能研究奠定了理论基础。

关键词：奶山羊乳腺上皮细胞 CREB 脂质代谢羊乳

circRNA-006258/miR-574-5p/EVI5L对奶山羊乳腺上皮细胞增殖和乳合成调控作用的研究

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circRNA-006258/miR-574-5p/EVI5L对奶山羊乳腺上皮细胞增殖和乳...

作者：张梦西北农林科技大学

学位级别：硕士

泌乳性状是重要的经济性状,乳腺是影响奶山羊泌乳性状的重要泌乳器官,乳腺的发育和泌乳是乳腺上皮细胞不断增殖、分化与凋亡等生理事件。近年来研究表明,非编码RNA广泛参与乳腺发育及泌乳等生理活动,其中包括:miRNA靶向调控m RNA的3’... 详细信息

泌乳性状是重要的经济性状,乳腺是影响奶山羊泌乳性状的重要泌乳器官,乳腺的发育和泌乳是乳腺上皮细胞不断增殖、分化与凋亡等生理事件。近年来研究表明,非编码RNA广泛参与乳腺发育及泌乳等生理活动,其中包括:miRNA靶向调控m RNA的3’非翻译区;circRNA“海绵”吸附miRNA等。基于实验室前期测序结果发现miR-574-5p在奶山羊泌乳高峰期和泌乳前期差异表达,而miR-574-5p对奶山羊乳腺上皮细胞具体的分子调控机理尚不清楚。本试验以关中奶山羊乳腺上皮细胞为研究对象,根据实验室前期测序和软件预测交叉所得到的miR-574-5p靶基因及circRNA数据库选定本试验研究的m RNA及circRNA。本试验通过建立奶山羊乳腺上皮细胞的体外培养体系,运用双荧光素酶报告系统检测miR-574-5p与EVI5L、miR-574-5p与circRNA-006258之间的靶向关系;通过RT-q PCR、Western blot、CCK-8、Ed U、细胞凋亡等检测circRNA-006258/miR-574-5p/EVI5L对奶山羊乳腺上皮细胞增殖和乳合成的调控作用。本试验的主要研究结果如下:***5L是miR-574-5p的靶基因分别构建EVI5L野生型和突变型双荧光素酶报告载体,检测双荧光素酶相对活性可知,EVI5L的野生型载体显著下调双荧光素酶活性,而突变型载体无明显变化,由此得出结论,EVI5L是miR-574-5p的靶基因;通过RT-q PCR和WB试验可知,miR-574-5p mimic可以降低EVI5L在m RNA和蛋白水平的表达,而miR-574-5p inhibitor使EVI5L在m RNA和蛋白水平的表达都显著升高。由此得出结论,EVI5L是miR-574-5p的靶基因并受到miR-574-5p的抑制。***-006258通过吸附miR-574-5p解除其对EVI5L的抑制作用将所构circRNA-006258的野生型和突变型CHECK2载体与miR-574-5p mimics、inhibitor、NC及inhibitor NC分别共转至GMECs,双荧光素酶活性检测结果显示,野生型载体的双荧光酶活性显著降低,突变型载体则无显著性变化;通过合成si-circRNA-006258,将si-circRNA-006258和NC分别转染至GMECs中,通过RT-q PCR、WB试验检测EVI5L m RNA和蛋白水平表达情况,发现si-circRNA-006258组中EVI5L的m RNA和蛋白水平都显著低于NC组。由此得出结论circRNA-006258通过海绵吸附miR-574-5p解除其对EVI5L的抑制作用。***-006258/miR-574-5p/EVI5L调节乳腺上皮细胞增殖及乳合成信号通路构建EVI5L的过表达载体,分别合成EVI5L和circRNA-006258的干扰RNA,分别转染至GMECs,通过WB试验,探索circRNA-006258/miR-574-5p/EVI5L轴调节乳腺上皮细胞增殖及乳合成的信号通路。试验结果显示,circRNA-006258/miR-574-5p/EVI5L可以通过Rab23/ITGB1/TIAM1/Rac1-TGF-β/Smad通路调节GMECs的细胞周期,促进其S期;提高Bcl2的蛋白表达量,减少Bax的蛋白表达,从而调控GMECs的细胞增殖;激活PI3K/AKT-m TOR信号通路促进GMECs中甘油三酯和β-酪蛋白的生成。综上所述,本试验初步验证了circRNA-006258作为miR-574-5p的分子海绵对其有吸附作用,从而解除miR-574-5p对EVI5L的抑制作用,从circRNA、miRNA和m RNA三个方面,并构建circRNA-006258/miR-574-5p/EVI5L轴,全面地阐述影响奶山羊乳腺上皮细胞增殖及乳合成的分子机理,为奶山羊泌乳以及精准育种提供科学依据。

关键词： EVI5L circRNA miR-574-5p 奶山羊乳腺上皮细胞乳合成

miR-142-3p对奶山羊乳腺上皮细胞泌乳功能的调控

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miR-142-3p对奶山羊乳腺上皮细胞泌乳功能的调控

作者：王褚悦东北农业大学

学位级别：硕士

具有泌乳功能的乳腺是哺乳动物的特殊腺体。为了提高奶山羊的泌乳量,研究者们在分子生物学的基础上对乳腺进行了大量的研究。mi RNA是一类长度约为185个核苷酸组成的单链非编码RNA,大量存在于在人类和哺乳动物的细胞中并发挥着重要的调... 详细信息

具有泌乳功能的乳腺是哺乳动物的特殊腺体。为了提高奶山羊的泌乳量,研究者们在分子生物学的基础上对乳腺进行了大量的研究。mi RNA是一类长度约为185个核苷酸组成的单链非编码RNA,大量存在于在人类和哺乳动物的细胞中并发挥着重要的调节作用。本研究以奶山羊乳腺上皮细胞中的mi R-142-3p为研究对象,通过使用mi Rbase数据库对mi R-142-3p靶位点预测发现,mi R-142-3p以不完全配对的方式结合于催乳素受体(PRLR)3’UTR区域即它们之间存在靶向关系,所以推测mi R-142-3p可能与奶山羊乳腺上皮细胞泌乳功能密切相关。本研究旨在通过mi R-142-3p基因过表达与抑制,进一步研究mi R-142-3p对奶山羊乳腺上皮细胞的泌乳调节作用。本研究利用脂质体载体向奶山羊乳腺上皮细胞中转染mi R-142-3p mimics和mi R-142-3p inhibitor并作用48h,进而研究mi R-142-3p对奶山羊乳腺上皮泌乳功能的调控作用。应用q RT-PCR检测技术检测Prlr及其相关通路基因的变化;利用Western blotting方法检测mi R-142-3p对PRLR等泌乳相关通路蛋白的影响;利用免疫荧光检测PRLR在奶山羊乳腺上皮细胞中的定位及表达;应用EDU法检测奶山羊乳腺上皮细胞增殖;应用流式检测法检测奶山羊乳腺上皮细胞周期及凋亡;使用CCK试剂盒检测奶山羊乳腺上皮细胞活力的变化。同时收集作用48h后的培养液,应用TG试剂盒检测奶山羊乳腺上皮细胞甘油三酯的分泌的变化及乳糖试剂盒检测其分泌乳糖的变化情况。实验结果表明:①应用q RT-PCR方法分别检测过表达及抑制mi R-142-3p时mi R-142-3p与靶基因Prlr的变化,mi R-142-3p过表达,mi R-142-3p表达量升高,Prlr下调;mi R-142-3p抑制,mi R-142-3p表达量降低,Prlr上调。②Western blotting技术检测结果显示,mi R-142-3p过表达时,奶山羊乳腺上皮细胞中PRLR、SREBP、AKT1、p-AKT1、m TOR、p-m TOR、STAT5、p-STAT5、CSN2、PPARγ、Cyclin D1表达量均下降;mi R-142-3p抑制时,奶山羊乳腺上皮细胞中PRLR、SREBP、AKT1、p-AKT1、m TOR、p-m TOR、STAT5、p-STAT5、CSN2、PPARγ、Cyclin D1表达均升高;过表达及抑制时,GLUT1均表达变化不显著。③利用免疫荧光结果显示,mi R-142-3p在细胞水平调控PRLR位置,并使PRLR表达水平降低。④应用EDU法检测奶山羊乳腺上皮细胞增殖,结果显示mi R-142-3p可抑制奶山羊乳腺上皮细胞增殖。⑤流式细胞检测法检测奶山羊乳腺上皮细胞周期及凋亡,发现mi R-142-3p可抑制细胞周期,促进细胞凋亡。⑥使用CCK法检测奶山羊乳腺上皮细胞活力的变化,结果显示mi R-142-3p可抑制细胞活力。⑦采用TG试剂盒及乳糖试剂盒分别检测奶山羊乳腺上皮细胞分泌甘油三酯及乳糖的变化情况,结果显示mi R-142-3p可抑制奶山羊乳腺上皮细胞甘油三酯的生物合成,但对乳糖分泌无显著影响。综上所述,mi R-142-3p通过抑制PRLR的表达,下调泌乳信号相关通路蛋白,从而抑制乳腺上皮奶山羊乳腺上皮细胞的增殖和活力,促进细胞凋亡,并对奶山羊乳腺上皮细胞的泌乳功能具有负向调节作用。

关键词：奶山羊乳腺上皮细胞泌乳 miR-142-3p PRLR

特定增强子序列对人乳铁蛋白基因在山羊乳腺上皮细胞中表达的影响

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特定增强子序列对人乳铁蛋白基因在山羊乳腺上皮细胞中表达的影响

作者：顾峰扬州大学

学位级别：硕士

本研究通过比较不同调控元件构建的乳腺特异性表达载体在山羊乳腺上皮细胞中的表达情况,特定增强子序列与乳蛋白启动子共同激活人乳铁蛋白cDNA在培养的山羊乳腺上皮细胞中表达,为研制乳腺特异性高效表达载体提供依据,为制备高表达转基... 详细信息

本研究通过比较不同调控元件构建的乳腺特异性表达载体在山羊乳腺上皮细胞中的表达情况,特定增强子序列与乳蛋白启动子共同激活人乳铁蛋白cDNA在培养的山羊乳腺上皮细胞中表达,为研制乳腺特异性高效表达载体提供依据,为制备高表达转基因克隆动物乳腺生物反应器提供具有表达潜能的体(供核)细胞。本实验所用乳腺特异性表达载体为实验室已有的乳腺特异性表达载体BLC-14与BnF95。两载体的区别只是BLC-14除了乳蛋白调控序列外还含有增强子序列。用胶原酶消化法从泌乳奶山羊的乳腺实质组织中分离得到乳腺上皮细胞,用DMEM/F12培养液培养乳腺上皮细胞。体外培养20代以上仍保持正常细胞繁殖扩增能力,生长良好。乳腺特异性表达载体BLC-14与BnF95通过电转染法分别导入奶山羊乳腺上皮细胞中,共转染5个细胞系,经含400ug/mLG418的筛选培养液筛选三周后,得到有抗性的阳性克隆细胞株,其中乳腺特异性表达载体BLC-14转染后共获得82株阳性克隆细胞株,乳腺特异性表达载体BnF95转染后共获得73株阳性克隆细胞株。挑取单克隆细胞株并进行扩大培养。各随机提取3株细胞DNA进行PCR检测,6株细胞PCR检测结果均为阳性。证明获得的抗性培养细胞系接近100%为转基因细胞系。阳性的细胞株进行诱导表达,经间接ELISA检测细胞诱导液,乳腺特异性表达载体BLC-14转染后有9株细胞能稳定表达人乳铁蛋白,而乳腺特异性表达载体BnF95转染后有7株细胞能稳定表达人乳铁蛋白。结果表明,乳腺特异性表达载体BLC-14与BnF95都能在奶山羊乳腺上皮细胞中表达,但两者在表达水平上存在显著差异(P奶山羊乳腺上皮细胞中的表达具有增强作用。

关键词：乳腺特异性奶山羊乳腺上皮细胞增强子电转染人乳铁蛋白

miR-143靶向调控MMP9和LOC108635657对奶山羊乳腺细胞的作用

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miR-143靶向调控MMP9和LOC108635657对奶山羊乳腺细胞的作用

作者：刘爽山东农业大学

学位级别：硕士

崂山奶山羊是乳用型山羊的优良品种之一。其乳腺生长发育的过程却是个复杂的过程,由多种调控因素控制;lncRNAs、miRNAs和基因是关键的调控因子,三者被认为通过构建ceRNA网络参与了对各种生物学过程的调控。本研究以前期研究的miR-143为... 详细信息

崂山奶山羊是乳用型山羊的优良品种之一。其乳腺生长发育的过程却是个复杂的过程,由多种调控因素控制;lncRNAs、miRNAs和基因是关键的调控因子,三者被认为通过构建ceRNA网络参与了对各种生物学过程的调控。本研究以前期研究的miR-143为基础,通过把奶山羊乳腺上皮细胞作为研究对象,实验组转染miR-143 mimics且分为M1、M2和M3三个文库;对照组不做任何处理,且分为C1、C2和C3三个文库,6个文库进行转录组测序筛选受其调控的差异表达基因,结合生物信息学分析,预测与之作用的lncRNAs,最终获取MMP9基因、miR-143和LOC108635657为研究对象,在体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞中,通过细胞转染、荧光定量PCR（qRT-PCR）、双荧光素酶报告基因检测和Western blot等实验,探寻miR-143靶向调控MMP9基因和LOC108635657对奶山羊乳腺细胞的作用,并阐述ceRNA网络对乳腺上皮细胞的调控作用,为深入研究miRNA-143在山羊乳腺上皮细胞生长发育中的功能提供了理论基础。其主要结果如下:（1）M1、M2、M3、C1、C2和C3等6个文库中分别筛选出82969530、67319936、81526696、81673114、80493910和81915328个Clean reads,6个样本过滤后得到纯净的Reads数占过滤前Reads数的比例均在96%以上。其中70%的外显子可以比对到山羊基因组上,比对率达到合格水平。对差异表达的mRNA分析发现,M1-C1、M2-C2、M3-C3和M-C组中分别有1804、1973、1879和1005个差异表达的mRNA,四个分组中共有的689个差异表达mRNA;GO分析发现差异表达的mRNA在Biological Process富集到146个条目上,在Cellular Component富集到20个条目上,在Molecular Function富集到23个条目上,这些条目主要是维持细胞外环境、调节免疫反应和酶活性等;KEGG分析发现差异表达的mRNA富集在7个通路上,这些通路主要是在维持新陈代谢和合成类固醇等。（2）通过构建MMP9基因野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体并分别和miR-143 mimics、mimics NC转染至293T细胞中,结果显示miR-143 mimics和MMP9野生型组中荧光素酶表达活性极显著低于其它三组（p＜0.01）,这表明miR-143能与MMP9基因直接靶向结合。qRT-PCR结果显示miR-143过表达后,MMP9基因的表达水平极显著降低（p＜0.01）,这说明miR-143可以调控MMP9基因的表达。Western blot结果显示miR-143过表达后,MMP9基因的蛋白表达水平极显著降低（p＜0.01）,进一步验证了qRT-PCR的结果。综上所述,miR-143通过与MMP9基因靶向结合来调控其表达。（3）通过构建LOC108635657野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体并分别和miR-143 mimics、mimics NC转染至293T细胞中,结果显示miR-143 mimics和LOC1-08635657野生型组中荧光素酶表达活性极显著低于其它三组（p＜0.01）,这表明miR-143能与LOC108635657直接靶向结合。qRT-PCR结果显示miR-143过表达后,LOC108635657的表达水平极显著降低（p＜0.01）,这说明miR-143可以调控LOC108635657的表达。综上所述,miR-143通过与LOC108635657靶向结合来调控其表达。（4）通过qRT-PCR和Western blot对LOC108635657沉默进行检测,qRT-PCR结果显示,当LOC108635657沉默后,miR-143的表达水平显著升高（p＜0.01）,MMP9基因的表达水平显著降低（p＜0.05）,这表明LOC108635657可以调控MMP9基因的表达。Western blot结果显示,LOC108635657沉默后,MMP9基因的蛋白表达水平极显著降低（p＜0.01）,进一步验证了qRT-PCR的结果。综上所述,LOC108635657可以调控MMP9基因的表达。通过以上实验可以发现,miR-143能分别靶向MMP9基因和LOC108635657,并与LOC108635657、MMP9基因相互影响,共同发挥作用;LOC108635657通过靶向结合miR-143对靶MMP9基因起调控作用。

关键词：奶山羊乳腺上皮细胞基质金属蛋白酶-9 长链非编码RNA miR-143 竞争性内源RNA

十八碳脂肪酸调控奶山羊SREBP1表达的分子机制研究

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十八碳脂肪酸调控奶山羊SREBP1表达的分子机制研究

作者：曲赫选西北农林科技大学

学位级别：硕士

硬脂酸、油酸、亚麻酸、反10顺12共轭亚油酸、顺9反11共轭亚油酸等十八碳脂肪酸通过在动物日粮中添加,对泌乳性能和脂肪酸合成相关基因产生影响。本研究的主要目的是探究t10c12-CLA通过固醇元件结合蛋白1（SREBP1）调控山羊乳腺上皮细... 详细信息

硬脂酸、油酸、亚麻酸、反10顺12共轭亚油酸、顺9反11共轭亚油酸等十八碳脂肪酸通过在动物日粮中添加,对泌乳性能和脂肪酸合成相关基因产生影响。本研究的主要目的是探究t10c12-CLA通过固醇元件结合蛋白1（SREBP1）调控山羊乳腺上皮细胞乳成分代谢的分子机制。首先采集了奶山羊乳腺组织,分离得到乳腺上皮细胞。使用十八碳脂肪酸对乳腺上皮细胞进行处理,利用转录组测序技术对差异基因和显著富集的信号通路进行分析,对蛋白表达水平进行检测以及与信号通路抑制剂相结合对细胞信号转导进行研究,获得如下结果:1.对体外培养的乳腺上皮细胞（GMECs）分别添加五种浓度为100μM的十八碳脂肪酸（硬脂酸、油酸、亚麻酸、反10顺12共轭亚油酸、顺9反11共轭亚油酸）,处理72h后发现,t10c12-CLA对SREBP1有显著的抑制作用（P＜0.05）。随后用100μM t10c12-CLA处理GMECs并测序分析后发现,与对照组之间存在差异表达的基因数量有49个。KEGG富集分析发现,与糖脂代谢密切相关的AMPK信号通路和多个与脂代谢相关的基因被显著富集。2.在GMECs中添加100μM t10c12-CLA处理12h、24h、72h后发现,处理72h时AMPK磷酸化水平显著上调（P＜0.05）,m TOR磷酸化水平显著下调（P＜0.05）SREBP1蛋白表达被显著抑制（P＜0.01）。之后引入AMPK抑制剂进一步发现,t10c12-CLA通过激活AMPK抑制了SREBP1的表达。3.在GMECs中单独或混合添加t10c12-CLA、AMPK抑制剂Dorsomorphin后发现,GMECs中的β-酪蛋白表达无影响（P＞0.05）;脂滴减少（P＜0.01）,脂肪酸中C16（P＜0.01）和C18（P＜0.05）含量降低,脂肪酸代谢基因被抑制;葡萄糖转运相关基因GLUT8的m RNA表达水平被下调（P＜0.05）。综上,t10c12-CLA在调控奶山羊乳成分代谢过程中起到了非常重要的作用,能够使羊奶中脂肪酸含量明显降低,还参与糖代谢,以上结果可能是通过t10c12-CLA激活AMPK进而影响SREBP1表达造成的。

关键词：奶山羊乳腺上皮细胞共轭亚油酸信号通路