miR-143靶向调控MMP9和LOC108635657对奶山羊乳腺细胞的作用
作者单位：山东农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：王建民
授予年度：2020年
主 题：奶山羊乳腺上皮细胞 基质金属蛋白酶-9 长链非编码RNA miR-143 竞争性内源RNA
摘 要：崂山奶山羊是乳用型山羊的优良品种之一。其乳腺生长发育的过程却是个复杂的过程,由多种调控因素控制;lncRNAs、miRNAs和基因是关键的调控因子,三者被认为通过构建ceRNA网络参与了对各种生物学过程的调控。本研究以前期研究的miR-143为基础,通过把奶山羊乳腺上皮细胞作为研究对象,实验组转染miR-143 mimics且分为M1、M2和M3三个文库;对照组不做任何处理,且分为C1、C2和C3三个文库,6个文库进行转录组测序筛选受其调控的差异表达基因,结合生物信息学分析,预测与之作用的lncRNAs,最终获取MMP9基因、miR-143和LOC108635657为研究对象,在体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞中,通过细胞转染、荧光定量PCR（qRT-PCR）、双荧光素酶报告基因检测和Western blot等实验,探寻miR-143靶向调控MMP9基因和LOC108635657对奶山羊乳腺细胞的作用,并阐述ceRNA网络对乳腺上皮细胞的调控作用,为深入研究miRNA-143在山羊乳腺上皮细胞生长发育中的功能提供了理论基础。其主要结果如下:（1）M1、M2、M3、C1、C2和C3等6个文库中分别筛选出82969530、67319936、81526696、81673114、80493910和81915328个Clean reads,6个样本过滤后得到纯净的Reads数占过滤前Reads数的比例均在96%以上。其中70%的外显子可以比对到山羊基因组上,比对率达到合格水平。对差异表达的mRNA分析发现,M1-C1、M2-C2、M3-C3和M-C组中分别有1804、1973、1879和1005个差异表达的mRNA,四个分组中共有的689个差异表达mRNA;GO分析发现差异表达的mRNA在Biological Process富集到146个条目上,在Cellular Component富集到20个条目上,在Molecular Function富集到23个条目上,这些条目主要是维持细胞外环境、调节免疫反应和酶活性等;KEGG分析发现差异表达的mRNA富集在7个通路上,这些通路主要是在维持新陈代谢和合成类固醇等。（2）通过构建MMP9基因野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体并分别和miR-143 mimics、mimics NC转染至293T细胞中,结果显示miR-143 mimics和MMP9野生型组中荧光素酶表达活性极显著低于其它三组（p0.01）,这表明miR-143能与MMP9基因直接靶向结合。qRT-PCR结果显示miR-143过表达后,MMP9基因的表达水平极显著降低（p0.01）,这说明miR-143可以调控MMP9基因的表达。Western blot结果显示miR-143过表达后,MMP9基因的蛋白表达水平极显著降低（p0.01）,进一步验证了qRT-PCR的结果。综上所述,miR-143通过与MMP9基因靶向结合来调控其表达。（3）通过构建LOC108635657野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体并分别和miR-143 mimics、mimics NC转染至293T细胞中,结果显示miR-143 mimics和LOC1-08635657野生型组中荧光素酶表达活性极显著低于其它三组（p0.01）,这表明miR-143能与LOC108635657直接靶向结合。qRT-PCR结果显示miR-143过表达后,LOC108635657的表达水平极显著降低（p0.01）,这说明miR-143可以调控LOC108635657的表达。综上所述,miR-143通过与LOC108635657靶向结合来调控其表达。（4）通过qRT-PCR和Western blot对LOC108635657沉默进行检测,qRT-PCR结果显示,当LOC108635657沉默后,miR-143的表达水平显著升高（p0.01）,MMP9基因的表达水平显著降低（p0.05）,这表明LOC108635657可以调控MMP9基因的表达。Western blot结果显示,LOC108635657沉默后,MMP9基因的蛋白表达水平极显著降低（p0.01）,进一步验证了qRT-PCR的结果。综上所述,LOC108635657可以调控MMP9基因的表达。通过以上实验可以发现,miR-143能分别靶向MMP9基因和LOC108635657,并与LOC108635657、MMP9基因相互影响,共同发挥作用;LOC108635657通过靶向结合miR-143对靶MMP9基因起调控作用。
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