特定增强子序列对人乳铁蛋白基因在山羊乳腺上皮细胞中表达的影响

作     者：顾峰 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：成勇

授予年度：2007年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：乳腺特异性 奶山羊乳腺上皮细胞 增强子 电转染 人乳铁蛋白 

摘      要：本研究通过比较不同调控元件构建的乳腺特异性表达载体在山羊乳腺上皮细胞中的表达情况,特定增强子序列与乳蛋白启动子共同激活人乳铁蛋白cDNA在培养的山羊乳腺上皮细胞中表达,为研制乳腺特异性高效表达载体提供依据,为制备高表达转基因克隆动物乳腺生物反应器提供具有表达潜能的体(供核)细胞。 本实验所用乳腺特异性表达载体为实验室已有的乳腺特异性表达载体BLC-14与BnF95。两载体的区别只是BLC-14除了乳蛋白调控序列外还含有增强子序列。 用胶原酶消化法从泌乳奶山羊的乳腺实质组织中分离得到乳腺上皮细胞,用DMEM/F12培养液培养乳腺上皮细胞。体外培养20代以上仍保持正常细胞繁殖扩增能力,生长良好。 乳腺特异性表达载体BLC-14与BnF95通过电转染法分别导入奶山羊乳腺上皮细胞中,共转染5个细胞系,经含400ug/mLG418的筛选培养液筛选三周后,得到有抗性的阳性克隆细胞株,其中乳腺特异性表达载体BLC-14转染后共获得82株阳性克隆细胞株,乳腺特异性表达载体BnF95转染后共获得73株阳性克隆细胞株。 挑取单克隆细胞株并进行扩大培养。各随机提取3株细胞DNA进行PCR检测,6株细胞PCR检测结果均为阳性。证明获得的抗性培养细胞系接近100%为转基因细胞系。阳性的细胞株进行诱导表达,经间接ELISA检测细胞诱导液,乳腺特异性表达载体BLC-14转染后有9株细胞能稳定表达人乳铁蛋白,而乳腺特异性表达载体BnF95转染后有7株细胞能稳定表达人乳铁蛋白。 结果表明,乳腺特异性表达载体BLC-14与BnF95都能在奶山羊乳腺上皮细胞中表达,但两者在表达水平上存在显著差异(P0.05)。表明特定增强子序列对外源基因在奶山羊乳腺上皮细胞中的表达具有增强作用。