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人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体的构建及转染研究

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2007年第1期35卷 29-32页

作者：张晶晶刘凤军彭淑英宋红卫张涌西北农林科技大学生物工程研究所陕西杨凌712100

构建了携带人乳铁蛋白(LTF)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的乳腺特异性表达载体(pEBL),用脂质体法转染泌乳期莎能奶山羊乳腺上皮细胞,转染后于荧光显微镜下观察GFP表达情况。用G 418对转染细胞进行筛选,获得抗性细胞克隆,并对转染细胞进... 详细信息

构建了携带人乳铁蛋白(LTF)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的乳腺特异性表达载体(pEBL),用脂质体法转染泌乳期莎能奶山羊乳腺上皮细胞,转染后于荧光显微镜下观察GFP表达情况。用G 418对转染细胞进行筛选,获得抗性细胞克隆,并对转染细胞进行PCR检测。结果显示,pEBL构建成功,转染6 h后可观察到细胞有GFP表达,PCR检测阳性克隆细胞转有LTF基因。表明pEBL载体已转染山羊乳腺上皮细胞,为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了基础。

关键词：山羊乳腺上皮细胞人乳铁蛋白绿色荧光蛋白特异性载体

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人乳铁蛋白基因对牛乳成分影响的初步研究

食品工业科技 2009年第7期30卷 185-186页

作者：杨鹏华倪凤娥长江大学生命科学学院湖北荆州404325

利用转基因家畜生产人乳铁蛋白已经成为现实,但是外源基因的转入对宿主影响的研究报道较少。本研究以人乳铁蛋白转基因牛乳为对象,分析其乳成分变化,比较转基因牛乳与常乳的异同。结果表明,尽管人乳铁蛋白在转基因牛乳中高水平表达,但... 详细信息

利用转基因家畜生产人乳铁蛋白已经成为现实,但是外源基因的转入对宿主影响的研究报道较少。本研究以人乳铁蛋白转基因牛乳为对象,分析其乳成分变化,比较转基因牛乳与常乳的异同。结果表明,尽管人乳铁蛋白在转基因牛乳中高水平表达,但是并没有影响牛乳中的常规成分,并且也没有影响牛乳中其它乳蛋白的表达。

关键词：人乳铁蛋白牛乳成分

人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体的构建及其功能的验证

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2011年第3期32卷 6-10页

作者：袁玉国安礼友于宝利杨廷佳成勇扬州大学兽医学院/江苏省转基因动物制药工程研究中心江苏扬州225009

构件pbCNCS/LF36经微注射获得转基因小鼠,同时为了准确筛选出整合的单克隆细胞,增加1个Cre/LoxP-GFP-Neo系统构建成pAPLM,将其转染山羊胎儿成纤维细胞筛选阳性细胞。结果表明:小鼠受体妊娠率28.5%,产仔32个,PCR整合检测4只阳性(3♀、1♂... 详细信息

构件pbCNCS/LF36经微注射获得转基因小鼠,同时为了准确筛选出整合的单克隆细胞,增加1个Cre/LoxP-GFP-Neo系统构建成pAPLM,将其转染山羊胎儿成纤维细胞筛选阳性细胞。结果表明:小鼠受体妊娠率28.5%,产仔32个,PCR整合检测4只阳性(3♀、1♂,整合率12.5%)。构件产生的3只母鼠和4号后代母鼠乳汁中重组人乳铁蛋白(hLF)用ELISA方法检测,表达量分别为3.8、2.8、***-1,4号后代3只母鼠表达量分别为4.2、3.9、***-1。构件pAPLM片段转染细胞后,经G418筛选,挑取单克隆扩大培养,其中8株PCR阳性克隆细胞荧光显微镜观察100%都有GFP的表达。以上结果证实,双启动子能调控外源基因在乳腺中特异高水平表达hLF,双标记基因可提高筛选阳性供核细胞的准确性,这为进一步作体细胞转基因克隆奠定基础。

关键词：人乳铁蛋白双标记基因双启动子小鼠胎儿成纤维细胞荧光蛋白

人乳铁蛋白对卵巢上皮性癌细胞增殖及细胞免疫调节的作用

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中华妇产科杂志 2012年第6期47卷 467-469页

作者：仇志琴陶永辉黄玉政张英成勇南京医科大学附属无锡市第二人民医院妇产 214002 江苏省血吸虫病防治研究所扬州大学江苏省转基因制药研究中心

利用天然或合成的化合物对恶性肿瘤的发生、发展进行干预是近年来的研究热点。人乳铁蛋白（human lactoferrin，hLF）是一种相对分子质量为76000的糖蛋白，存在于多种体液或分泌物中，以人乳汁特别是初乳中含量最高，具有抗肿瘤、抗细... 详细信息

利用天然或合成的化合物对恶性肿瘤的发生、发展进行干预是近年来的研究热点。人乳铁蛋白（human lactoferrin，hLF）是一种相对分子质量为76000的糖蛋白，存在于多种体液或分泌物中，以人乳汁特别是初乳中含量最高，具有抗肿瘤、抗细菌、抗病毒等多种生理功能。

关键词：人乳铁蛋白细胞免疫调节癌细胞增殖卵巢上皮性相对分子质量恶性肿瘤生理功能化合物

人乳铁蛋白(hLF)cDNA的克隆及序列分析

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四川大学学报（自然科学版） 2005年第6期42卷 1229-1232页

作者：蔡佩玲童英王晓强张义正四川大学生命科学学院四川成都610064

从正常人外周血中分离中性粒白细胞(WBC),提取总RNA,用RT-PCR的方法扩增人乳铁蛋白(hLF)***分hLF 1.5h、LF 0.8两段扩增并连入pMD18-T载体上,再利用限制酶连入巴氏毕赤酵母表达载体pPICZ-αA中,构成完整的hLF基因.序列测定表明,所克隆的... 详细信息

从正常人外周血中分离中性粒白细胞(WBC),提取总RNA,用RT-PCR的方法扩增人乳铁蛋白(hLF)***分hLF 1.5h、LF 0.8两段扩增并连入pMD18-T载体上,再利用限制酶连入巴氏毕赤酵母表达载体pPICZ-αA中,构成完整的hLF基因.序列测定表明,所克隆的hLF基因序列全长为2,136bp,与Gene Bank中登录的序列相比,同源性达99%以上.

关键词：中性粒白细胞人乳铁蛋白 cDNA克隆 DNA序列分析

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人乳铁蛋白对细胞增殖的影响

中国老年学杂志 2010年第4期30卷 504-505页

作者：仇志琴李志沭黄玉政杨欢成勇南京医科大学附属无锡市第二人民医院江苏无锡214002 扬州大学江苏省转基因制药工程研究中心江苏省沭阳人民医院苏州大学附属第二医院

目的探讨人乳铁蛋白(hLF)对体外培养细胞生长特性的影响。方法MTT法评定hLF对人鼻咽癌细胞、中国仓鼠卵巢细胞、人肝脏细胞的生长抑制作用。结果乳铁蛋白对人鼻咽癌细胞系CNE的增殖有抑制作用并呈现剂量依赖性,对正常细胞无抑制作用。结... 详细信息

目的探讨人乳铁蛋白(hLF)对体外培养细胞生长特性的影响。方法MTT法评定hLF对人鼻咽癌细胞、中国仓鼠卵巢细胞、人肝脏细胞的生长抑制作用。结果乳铁蛋白对人鼻咽癌细胞系CNE的增殖有抑制作用并呈现剂量依赖性,对正常细胞无抑制作用。结论hLF可能是一种效果较好的新的抗肿瘤化学剂。

关键词：人乳铁蛋白癌细胞细胞增殖

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人乳铁蛋白基因克隆及细胞表达研究

遗传 2002年第1期24卷 9-14页

作者：曹阳高华颖于黎袁晓东李庆伟汤敏谦安利佳大连理工大学化工学院生物工程系辽宁大连116012 辽宁师范大学生命科学院辽宁大连116029 宝生物工程(大连)有限公司辽宁大连116600

通过PCR法直接克隆了 2 .36 6kb的人乳铁蛋白基因cDNA序列及 80 0bp的山羊 β.M乳球蛋白基因 5′端调控序列 ,并连接到表达载体pLNCX中。利用脂质体包裹含人乳铁蛋白基因cDNA的重组质粒pLNCXHLF ,并导入到小鼠乳腺癌细胞株MA.M 782中 ,G... 详细信息

通过PCR法直接克隆了 2 .36 6kb的人乳铁蛋白基因cDNA序列及 80 0bp的山羊 β.M乳球蛋白基因 5′端调控序列 ,并连接到表达载体pLNCX中。利用脂质体包裹含人乳铁蛋白基因cDNA的重组质粒pLNCXHLF ,并导入到小鼠乳腺癌细胞株MA.M 782中 ,G418及PCR筛选获得阳性单克隆细胞 ,增殖后 ,转染细胞利用海藻酸钠固定化包埋培养 ,经激素诱导 ,培养液上清通过Western印记检测证明 ,转染细胞表达并分泌出人乳铁蛋白 ,分子质量为34kDa;ELISA法测出 ,每升培养基 (含 10 5个细胞 )重组蛋白最高表达量为 6 5mg ;抗菌实验表明 ,所获得的重组人乳铁蛋白具有抑制大肠杆菌生长的作用 ,而且比人乳铁蛋白标准品作用更强。

关键词：人乳铁蛋白脂质体固定化细胞表达基因克隆

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沙漠小球藻转人乳铁蛋白的电转优化

食品与生物技术学报 2018年第9期37卷 915-923页

作者：汪文伦牟云胡梦薇许万云严国王会敏高剑峰石河子大学生命科学学院新疆石河子832000

对沙漠小球藻建立高效的遗传转化方法,对电击转化的条件和相关参数进行优化。作者以人乳铁蛋白基因作为电转条件优化的参考基因,采用单因素实验确定转染效率的电转化条件,然后进行电转化正交实验,得到最优的电转化组合。结果表明:最优... 详细信息

对沙漠小球藻建立高效的遗传转化方法,对电击转化的条件和相关参数进行优化。作者以人乳铁蛋白基因作为电转条件优化的参考基因,采用单因素实验确定转染效率的电转化条件,然后进行电转化正交实验,得到最优的电转化组合。结果表明:最优的电转化组合是电压1 400 V、培养周期8 d、渗透剂浓度0.2 mol/L、渗透时间为0 h、质粒质量浓度为6 ug/mL、电击缓冲液浓度为0.4 mol/L,其细胞致死率为51.30%、荧光百分率为52.54%、PCR阳性平均百分率为42.30%。

关键词：电转化小球藻人乳铁蛋白正交实验细胞致死率荧光百分率 PCR阳性率

转录激活因子样效应物核酸酶介导的山羊β-乳球蛋白基因敲除和人乳铁蛋白基因定点整合

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生物工程学报 2016年第3期32卷 329-338页

作者：宋绍征朱孟敏袁玉国荣耀徐晟陈思梅珺琰成勇扬州大学兽医学院江苏省转基因动物制药工程研究中心江苏扬州225009 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

为了敲除山羊乳中致敏源β-乳球蛋白(BLG)基因,同时在BLG基因座定点整合人乳铁蛋白(hLF)基因。首先针对山羊BLG第3外显子识别位点设计了1对特异性TALEN-3-L/R质粒对;同时,构建了含有1个HSV-TK负筛选基因的hLF基因打靶载体BLC14-TK。TAL... 详细信息

为了敲除山羊乳中致敏源β-乳球蛋白(BLG)基因,同时在BLG基因座定点整合人乳铁蛋白(hLF)基因。首先针对山羊BLG第3外显子识别位点设计了1对特异性TALEN-3-L/R质粒对;同时,构建了含有1个HSV-TK负筛选基因的hLF基因打靶载体BLC14-TK。TALENs质粒对转染山羊胎儿成纤维细胞,2μg/m L嘌呤霉素筛选3 d,PCR扩增产物测序来验证其切割DNA活性。打靶载体BLC14-TK与TALEN-3-L/R质粒对共转染山羊胎儿成纤维细胞,经700μg/m L G418和2μg/m L GCV共筛选药物抗性细胞株;通过整合检测和同源重组检测来筛选hLF基因打靶细胞株;BLG~–/hLF^+打靶细胞株作为供核细胞进行山羊体细胞核移植。结果为:TALEN-3-L/R致突变率为25%-30%;获得BLG~–/hLF^+打靶细胞6株;共制作重构胚胎335枚,移植受体山羊23只,B超检测到30-35 d的妊娠受体9只(妊娠率39.1%),其中1只50日龄克隆胎儿验证为BLG~–/hLF^+基因型。以上结果表明获得BLG基因座定点整合hLF基因的基因打靶山羊是可行的,为培育羊乳中含低致敏原和富含hLF的山羊新品系奠定了基础。

关键词： TALENs 人乳铁蛋白 BLG 基因打靶体细胞核移植