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天蚕素ad在黑曲霉中的异源高效表达及安全性评价

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天蚕素AD在黑曲霉中的异源高效表达及安全性评价

作者：张锦涛东北农业大学

学位级别：硕士

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是由生物体诱导的具有抗菌活性的小肽。它们在大多数生物体的免疫系统中发挥重要作用,能有效杀灭病原体,抵御外来细菌和病毒的入侵。天蚕素作为最早发现的抗菌肽,也是迄今为止最有效的抗菌肽之一。... 详细信息

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是由生物体诱导的具有抗菌活性的小肽。它们在大多数生物体的免疫系统中发挥重要作用,能有效杀灭病原体,抵御外来细菌和病毒的入侵。天蚕素作为最早发现的抗菌肽,也是迄今为止最有效的抗菌肽之一。天蚕素ad(Cecropin ad,Cad)是由天蚕素A的N端第1～11肽段与天蚕素D的C端的第12～37肽段构成的杂合肽,具有较强的抗菌和抗病毒活性。人工合成的杂合肽天蚕素ad其性能明显优于天然抗菌肽,因此被广泛应用于饲料添加剂和食品防腐剂中。目前多采用化学合成的方式得到Cad,但其合成工艺过于复杂繁琐,成本过高,因此利用基因工程技术实现天蚕素ad的高效表达并实现其工业化生产变得十分重要。本试验基于实验室前期构建的p SZHG6R-Xyn B表达载体,成功筛选获得了天蚕素基因单拷贝和双拷贝的黑曲霉重组生产菌株,并尝试通过发酵条件的优化,以寻找提升分泌表达产量的有效方案,同时对所得蛋白进行了抗菌效果和生物学性质的检测。主要结果如下:1.通过重叠延伸PCR技术扩增出带有限制性内切酶NheⅠ、HindⅢ酶切位点的单拷贝Cad基因和双拷贝Cad基因,将其与含有相同酶切位点的载体p SGH6R连接,构建黑曲霉表达载体p SGH6R-Cad、p SGH6R-(Cad)。2.采用冻融法将黑曲霉表达载体p SGH6R-Cad、p SGH6R-(Cad)转化到农杆菌AGL1中,并使用农杆菌介导法转化黑曲霉TH-2,提取菌丝基因组进行PCR鉴定,得到黑曲霉重组菌株。3.将获得的重组纯合菌株摇瓶发酵,收集4～11 d的上清液,利用Tricine-SDS-PAGE小分子蛋白胶鉴定发酵产物,检测到一条分子量约为3.9k D条带,且双拷贝重组菌株的蛋白含量明显高于单拷贝重组菌株。Cad的实际理论分子量为3950.73Da,试验所得分子量大小与理论基本相符。4.对发酵培养基的碳源及初始p H进行了条件优化,以麦芽糖、可溶性淀粉与葡萄糖作为发酵培养基的唯一碳源,试验结果证明发酵培养基中的最佳碳源为葡萄糖,且初始p H值为6.0时,其抗菌效价是8.94×10 U/L,抑菌作用最佳。***对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌及枯草芽孢杆菌均有抑菌活性,对革兰氏阴性菌的抑制作用优于革兰氏阳性菌。***的耐高温性较强,将其100℃水浴3 h之后仍保持活性。Cad对蛋白酶的抵抗力也很强,用蛋白酶处理之后,其抗菌作用只有轻微抑制。通过溶血性试验检测,Cad显示出非溶血特性。综上,本试验在完成黑曲霉表达载体构建的基础上,通过农杆菌介导法将其转化至黑曲霉并筛选获得了重组菌株,对得到的纯合菌株的发酵产物进行了检测及优化了发酵条件,获得了能够稳定遗传的纯合黑曲霉。本研究利用基因工程技术在黑曲霉中成功表达Cad,为其在动物养殖、食品及医药行业的应用提供潜在可能。本研究结果将为生产人工抗菌肽提供新的途径,为安全高效地生产重组蛋白提供新的表达系统。

关键词：天蚕素ad 黑曲霉农杆菌生物效价抑菌活性

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天蚕素ad在毕赤酵母中的异源表达

天蚕素AD在毕赤酵母中的异源表达

作者：牛军波兰州交通大学

学位级别：硕士

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是大多数生物体先天性免疫系统的重要组成部分,是生物体经过诱导产生的一类具有抗菌活性的小肽类物质,可在生物体中有效杀灭病原菌以及抵御外来细菌和病毒的入侵。天蚕素ad为天蚕素抗菌肽的一种,天... 详细信息

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是大多数生物体先天性免疫系统的重要组成部分,是生物体经过诱导产生的一类具有抗菌活性的小肽类物质,可在生物体中有效杀灭病原菌以及抵御外来细菌和病毒的入侵。天蚕素ad为天蚕素抗菌肽的一种,天蚕素抗菌肽是目前研究最清楚、效果最显著的抗菌肽,因此实现其工业化生产可为其在农业、养殖业中的应用奠定基础。本研究分别使用AOX启动子和GAP启动子构建出诱导型基因工程菌株和组成型基因工程菌株,通过对其抑菌能力的检测以及菌株的遗传稳定性的观察,最终选用组成型表达菌株作为后续实验菌株。基于以上研究对天蚕素ad在毕赤酵母中的高效表达以及发酵条件进行了优化,并对其特性进行了检测。本研究为抗菌肽利用基因工程在毕赤酵母中成功表达并应用于养殖业、食品及医疗行业提供了科学数据及技术支持。主要实验结果如下:1.本文全基因合成天蚕素ad基因片段,利用引物扩增出带有Xho I和Not I位点的天蚕素ad基因,将其与同样双酶切的载体pPIC9K连接,将其转入大肠杆菌JM109感受态中,挑取转化子培养提取质粒,将得到的重组质粒pPIC9K-Cad转入毕赤酵母GS115中,挑取阳性克隆,得到两株抑菌效果较好的基因工程菌株GS115/pPIC9K-Cad-5和GS115/pPIC9K-Cad-9,甘油保存菌株。2.利用引物扩增出带有EcoR I和Not I位点的天蚕素ad基因,将其与同样双酶切的载体pGAPZαA连接,连接产物转入大肠杆菌感受态细胞,得到质粒pGAPZαA-Cad经线性化后电击转入毕赤酵母X33电击感受态中,得到基因工程菌株X33/GCad-3。将构建好的质粒pUCGAP-Cad电击转化至X33/GCad-3的电击感受态中,最终得到多拷贝菌株X33/GUCad-3,甘油保存菌株,以该菌株为后续实验菌株。3.利用Tricine-SDS-PAGE小分子蛋白胶和LC-MS鉴定X33/GUCad-3发酵产物,结果表明该抑菌物质为天蚕素ad。以YDFM、YPD和BMGY分别为发酵培养基,结果表明最适宜的发酵培养基为YDFM培养基。以甘油、葡萄糖和麦芽糖分别为唯一碳源,结果表明最适碳源为甘油。对氮源添加量及初始pH进行了条件优化,结果表明在其24 h和48 h分别补料5 g/L的有机氮源,且初始pH为7.0时,抑菌效果最好,其抗菌生物效价为8.84×10 U/L。4.确定了天蚕素ad的抗菌谱,表明其抗菌谱较广,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌活性,但对真菌无抑菌活性。天蚕素ad对部分常见致病菌均有抑菌活性。耐高温性较强,在100℃下放置3 h仍能具有较高抑菌活性。与未用蛋白酶处理的天蚕素ad相比,分别用30 U/mL的胃蛋白酶和蛋白酶K处理天蚕素ad 2.5 h时,其抑菌活性表现出一定程度的下降,且天蚕素ad在30 U/mL的胰蛋白酶下仍能具有一定的抑菌活性,但相对于未用胰蛋白酶处理的天蚕素ad,其抗菌活性出现较大程度的下降。通过溶血活性实验检测表明天蚕素ad不具有溶血活性。

关键词：天蚕素ad 毕赤酵母异源表达组成型表达生物效价抑菌活性

天蚕素ad抗菌肽在新城疫病毒载体系统中的表达及抑菌效果研究

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天蚕素AD抗菌肽在新城疫病毒载体系统中的表达及抑菌效果研究

作者：任项霏华中农业大学

学位级别：硕士

人类对抗生素的依赖导致其被滥用,最终导致产生大量的耐药菌甚至超级耐药菌。抗菌肽具有独特的作用机制不易使细菌产生耐药性,因此,抗菌肽有望成为最佳的抗生素替代品。天蚕素抗菌多肽(Cecropin)是最早被发现且杀菌/抑菌效果较好的抗菌... 详细信息

人类对抗生素的依赖导致其被滥用,最终导致产生大量的耐药菌甚至超级耐药菌。抗菌肽具有独特的作用机制不易使细菌产生耐药性,因此,抗菌肽有望成为最佳的抗生素替代品。天蚕素抗菌多肽(Cecropin)是最早被发现且杀菌/抑菌效果较好的抗菌肽,天蚕素ad(Cecropin ad,Cad)就是其中一种。因人工合成的成本昂贵,所以急需合适的表达系统来表达Cad抗菌多肽,使其可以广泛用于细菌病的治疗。本研究构建并拯救了表达Cad的新城疫载体活病毒疫苗候选株,通过免疫宿主在其体内持续产生Cad抗菌多肽,作用于感染部位并杀死细菌,从而起到治疗细菌病的目的。本课题的主要研究内容和结果如下:1、重组新城疫病毒全长质粒的构建及病毒拯救采用In-Fusion同源重组的方式将Cad和Cad基因片段分别插入至NDV TS09-C株载体的P和M基因之间的非编码区中,并利用反向遗传操作系统成功拯救出两种重组新城疫病毒r TS-Cad和r TS-Cad。重组病毒r TS-Cad能在SPF鸡胚中稳定增殖,但重组病毒r TS-Cad在传至第5代时发生Cad拷贝数缺失现象,不能稳定传代。通过生物学特性分析,在NDV TS09-C株的P和M基因之间插入Cad和Cad基因并不会改变亲本株的弱毒和增殖特性。间接免疫荧光试验证实重组新城疫病毒能在BHK-21细胞中成功表达抗菌肽Cad和Cad。2、重组新城疫病毒表达的天蚕素ad对细菌的抑制作用本研究采用生长曲线法、微孔板法和DF-1细胞共培养3种方法来验证重组病毒表达的Cad抗菌肽在体外对细菌的抑制作用。利用生长曲线法测定时发现,重组病毒组均在第2-4 h内抑菌效果最好,分别可将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,***)的存活率降低至47.0%-57.0%和9.9%-18.8%。微孔板法抑菌试验中,重组病毒组对***的抑制率分别为79.6%-91.7%和79.7%-93.7%;对大肠杆菌(Escherichia coli,***)的抑制率分别为87.5%-89.8%和79.7%-87.5%。与DF-1细胞共培养实验中,重组病毒组对***的抑制率分别可达到74.5%-77.7%和30.0%-68.0%;对***的抑制率分别为35.0%-45.0%和8.0%-45.0%。综上可知,NDV载体系统表达的Cad和Cad在体外对***(ATCC 29213)(G+)和***(ATCC 25922)(G-)均有一定的抑制作用,且对***的抑制效果更好。另外,利用不同试验方法测得r TS-Cad和r TS-Cad组的体外抑菌率无显著差异。为了证明重组病毒表达的Cad抗菌肽在体内的抑菌活性,建立小鼠伤口感染***的动物模型,再经皮下注射r TS-Cad和r TS-Cad两种重组病毒至伤口皮肤周围。接种后第7 d发现伤口处***数量与对照组相比显著减少(Pad组菌落数显著少于r TS-Cad组(Pad和r TS-Cad两组的皮肤组织的表皮局部增厚,皮下可见大量结缔组织增生以及大量新生的毛细血管,逐渐进入愈合四期,而对照组的皮肤结构不清,部分皮肤坏死,愈合缓慢。综上证明,重组病毒表达的Cad抗菌多肽可以在小鼠体内对***表现出较强的抑制作用,且r TS-Cad组抑制效果优于r TS-Cad组,同时也促进了小鼠伤口的快速愈合。3、鸡肺部和肠道菌群多样性分析本研究中,2周龄的SPF雏鸡分别接种r TS-Cad和r TS-Cad,7d-21d的NDV抗体水平与NDV载体对照组相比并没有显著提高。对鸡肺部菌群进行16S测序后发现,主要是由拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门以及放线菌门四大菌门组成。经样本群落结构分析可知,重组病毒组的鸡肺部菌群丰富度均提高。此外,通过Kruskal Wallis算法分析筛选出几种差异显著的菌群,如肠杆菌、乳酸菌和双歧杆菌等。分析结果发现,重组病毒组能够显著抑制肠杆菌和拟杆菌等致病菌,并且提高乳酸菌和双歧杆菌等益生菌的菌群丰度;表达Cad的重组病毒对肠杆菌等致病菌的抑制程度显著高于r TS-Cad组(Pad组显著低于r TS-Cad组(Pad组显著高于

关键词：天蚕素ad 新城疫病毒载体反向遗传操作系统抗菌肽菌群丰度

转天蚕素ad(Cad)基因于紫花苜蓿的研究

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华南农业大学学报 2012年第4期33卷 498-502页

作者：刘秀明朱海林杜淑环万秋李海燕李校堃吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心吉林长春130118 温州医学院浙江温州325035 吉林农业大学生命科学学院吉林长春130118

为了探索利用紫花苜蓿Medicago sativa作为生物反应器生产杂合抗菌肽天蚕素ad(Cecropin ad,Cad)的可行性,通过PCR搭桥方法合成了Cad全长基因,并插入对外源基因表达有一定促进作用的调控元件:Ω序列、Kozak序列及KDEL四肽序列,然后将改... 详细信息

为了探索利用紫花苜蓿Medicago sativa作为生物反应器生产杂合抗菌肽天蚕素ad(Cecropin ad,Cad)的可行性,通过PCR搭桥方法合成了Cad全长基因,并插入对外源基因表达有一定促进作用的调控元件:Ω序列、Kozak序列及KDEL四肽序列,然后将改造后的Cad基因克隆进载体pCAMBIA1390R,构建了pCAMBIA1390R-Cad植物表达载体.将重组质粒转入根癌农杆菌Agrobacterium tumefacienLBA4404,并通过农杆菌介导方法将Cad基因转化入紫花苜蓿.在含潮霉素(20 mg/L)的筛选培养基上筛选转基因植株,通过PCR、Southern blotting检测,Cad基因已经转入紫花苜蓿中;提取蛋白质进行抑菌活性研究,结果表明转基因苜蓿蛋白提取物对沙门氏菌Sal-monella及金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus具有一定抑菌活性.

关键词：紫花苜蓿抗菌肽天蚕素ad 转基因

新城疫载体系统表达天蚕素ad抗菌肽及其抑菌效果

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中国兽医学报 2023年第9期43卷 1820-1827页

作者：任项霏冯贺龙徐英英李丽杨宏春王鑫商雨阳柳君周祖涛李自力刘梅罗青平胡思顺温国元华中农业大学动物科学技术学院/动物医学院湖北武汉430070 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所湖北武汉430064 农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室湖北武汉430064 畜禽病原微生物学湖北省重点实验室湖北武汉430064 湖北洪山实验室湖北武汉430070 湖北省预防兽医学重点实验室湖北武汉430070

为探究天蚕素ad抗菌肽是否能在新城疫病毒(NDV)载体系统中表达,且通过该种表达系统得到的Cad是否有生物活性。采用同源重组的方式将Cad插入至NDV载体pTS09-C中,并利用反向遗传操作系统成功拯救出重组病毒rTS-Cad,该重组病毒能在SPF鸡胚... 详细信息

为探究天蚕素ad抗菌肽是否能在新城疫病毒(NDV)载体系统中表达,且通过该种表达系统得到的Cad是否有生物活性。采用同源重组的方式将Cad插入至NDV载体pTS09-C中,并利用反向遗传操作系统成功拯救出重组病毒rTS-Cad,该重组病毒能在SPF鸡胚中稳定增殖。通过生物学特性分析,在NDV TS09-C株的P和M基因之间插入Cad基因并未改变其的弱毒和增殖特性。间接免疫荧光试验证实重组病毒能在BHK-21细胞中稳定表达Cad抗菌肽。抑菌试验结果显示,NDV载体系统表达的Cad对金黄色葡萄球菌(G+)和大肠杆菌(G-)均有一定的抑制作用:在微孔板法抑菌试验中,重组病毒表达的Cad抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑制率为79.6%~91.7%,对大肠杆菌的抑制率为87.5%~89.8%;在与DF-1细胞共培养试验中,重组病毒表达的Cad抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑制率可以达到74.5%~77.7%,对大肠杆菌的抑制率为35.0%~45.0%。本研究表明,NDV载体系统能够成功表达出有活性的Cad抗菌肽,且有良好的抑菌效果。这一研究为探索NDV载体表达抗菌肽和进一步研究Cad的局部效应奠定了一定的理论基础。

关键词：天蚕素ad 新城疫病毒载体反向遗传操作系统抗菌肽

内含肽介导的天蚕素ad基因工程表达、其酰胺化及应用

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中国病原生物学杂志 2016年第8期11卷 705-709页

作者：周冠李蕾邓玮李希平俞超青岛康伦生物科技有限公司山东青岛266000

目的设计、合成天蚕素ad(Cad)基因序列,与内含肽(Intein)融合表达后通过重组蛋白自剪切作用获得C端酰胺化的Cad,并与抗生素配伍使用。方法根据大肠埃希菌密码子偏好性对Cad基因序列进行改造,人工合成目的基因,构建重组质粒pCold-SUMO-CA... 详细信息

目的设计、合成天蚕素ad(Cad)基因序列,与内含肽(Intein)融合表达后通过重组蛋白自剪切作用获得C端酰胺化的Cad,并与抗生素配伍使用。方法根据大肠埃希菌密码子偏好性对Cad基因序列进行改造,人工合成目的基因,构建重组质粒pCold-SUMO-Cad-Intein,转化大肠埃希菌,诱导表达重组蛋白,经镍柱亲和层析纯化,后用DTT及肠激酶切割,利用分子筛纯化获得酰胺化Cad,并进行电泳及质谱鉴定。采用微量肉汤法检测重组Cad抑菌活性及其与不同抗生素按不同比例配伍使用的抑菌活性。结果 PCR扩增目的基因片段为132bp,与预期一致。质谱显示表达的Cad分子质量单位为3.949ku,与理论值相符。所得Cad抗菌肽对常见革兰阴性菌抗菌力强,配伍抗生素使用能发挥协同抑菌作用。结论成功构建Cad基因重组质粒pCold-SUMO-Cad-Intein,通过与内含肽(Intein)融合表达,经分子内的自剪切作用直接获得C末端酰胺化的抗菌肽,与抗生素配伍使用,能显著降低抗生素用量,具有作为抗生素替代物的应用潜力。

关键词：天蚕素ad 表达酰胺化抗生素配伍

重组大肠杆菌利用乳糖自诱导系统融合表达天蚕素ad和蛙BuforinⅡ

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科学技术与工程 2014年第4期22卷 179-182页

作者：陈泉扈进冬李哲郭凯李纪顺杨合同山东省科学院中日友好生物技术研究中心山东省应用微生物重点实验室济南250014

以包含质粒pET-Trx-Cad-BuforinⅡ的大肠杆菌BL21(DE3)为研究对象,开发了一种利用乳糖自诱导方式表达天蚕素ad和蛙BuforinⅡ的表达系统。首先,在LB培养基中研究了乳糖浓度、诱导时机和诱导时间对目的蛋白表达的影响。然后,利用"分解代... 详细信息

以包含质粒pET-Trx-Cad-BuforinⅡ的大肠杆菌BL21(DE3)为研究对象,开发了一种利用乳糖自诱导方式表达天蚕素ad和蛙BuforinⅡ的表达系统。首先,在LB培养基中研究了乳糖浓度、诱导时机和诱导时间对目的蛋白表达的影响。然后,利用"分解代谢物阻遏"原理构建乳糖自诱导表达系统,以"葡萄糖+主碳源"两种碳源的依次代谢将蛋白表达过程分为两个阶段:第一阶段为菌体生长阶段,菌体利用葡萄糖生长,乳糖无法进入细胞诱导蛋白表达;第二阶段为蛋白表达阶段,葡萄糖耗尽,菌体开始利用主碳源生长;同时乳糖进入细胞诱导蛋白表达。最后,利用优选的"葡萄糖+木糖"组合自诱导表达天蚕素ad和BuforinⅡ的融合蛋白,得到的目的蛋白占全菌总蛋白含量的45.2%。

关键词：大肠杆菌乳糖自诱导天蚕素ad BuforinⅡ 融合表达

Cecropin ad在转基因苜蓿中的表达研究

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Cecropin AD在转基因苜蓿中的表达研究

作者：朱海林吉林农业大学

学位级别：硕士

近年来由于抗生素的大量使用,导致临床耐药株日益增多,故寻找新种类抗菌药成为当前的研究热点。抗菌肽热稳定、水溶性好、免疫原性较低、作用迅速等特点,不仅可以有效杀灭细菌、真菌、病毒和寄生虫,部分还有一定抗恶性肿瘤作用,并且不... 详细信息

近年来由于抗生素的大量使用,导致临床耐药株日益增多,故寻找新种类抗菌药成为当前的研究热点。抗菌肽热稳定、水溶性好、免疫原性较低、作用迅速等特点,不仅可以有效杀灭细菌、真菌、病毒和寄生虫,部分还有一定抗恶性肿瘤作用,并且不易产生耐药性,对真核细胞毒性作用低等特点。随着分子生物学和生物技术的飞速发展,转基因植物的研究取得了一系列突破性成就,愈来愈受到世人瞩目。用植物生物反应器生产重组疫苗、重组抗体和其他药用蛋白已成为国内外基因工程研究热点之一。植物作为反应器可以排除产品被内毒素或以人病原体污染的危险,在表达蛋白时可以不加工或部分加工后被采用。因此,植物生物反应器为重组蛋白的生产提供了广阔的前景。天蚕素ad(Cecropinad,Cad)是人工合成的由cecropin A的N端1～11肽段和cecropin D的C端12～37肽段组成的杂合肽,具有较高的抗菌活性和抗肿瘤活性。基于抗菌肽的天然含量低及其在医药中的重要作用,本研究通过基因工程的手段,在紫花苜蓿中表达按照植物偏好性密码子合成的天蚕素ad,探索利用紫花苜蓿作为反应器生产抗菌肽的可行性研究,为抗菌肽转基因苜蓿的产业化推广奠定基础。表达载体中插入了对外源基因表达有一定促进作用的调控元件：Q序列、Kozak序列及KDEL四肽序列;将其克隆进pCAMBIA1390中,构建了pCAMBIA1390Cad植物表达载体。将重组质粒转入农杆菌LBA4404,并通过农杆菌介导方法将Cad转化入紫花苜蓿。在含潮霉素(20mg/L)的筛选培养基上筛选转基因植株,通过PCR、Southern blotting和抑菌活性检测,得到以下结论：1.成功合成植物偏好密码子Cad基因。2.将测序正确Cad基因插入到pCAMBIA1390中,得到含Cad基因的植物表达载体pCAMBIA1390Cad。***和Southern杂交结果显示目的基因已经已成功整合到苜蓿基因组中。4. RT-PCR结果表明目的基因在苜蓿各个株系中都有转录。5.抑菌活性检测,结果表明Cad基因已经转入紫花苜蓿中,并成功得到表达。

关键词：转基因苜蓿抗菌肽天蚕素ad 植物生物反应器载体构建