天蚕素AD在黑曲霉中的异源高效表达及安全性评价

作     者：张锦涛 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李术;孙建宏

授予年度：2023年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：天蚕素AD 黑曲霉 农杆菌 生物效价 抑菌活性 

摘      要：抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是由生物体诱导的具有抗菌活性的小肽。它们在大多数生物体的免疫系统中发挥重要作用,能有效杀灭病原体,抵御外来细菌和病毒的入侵。天蚕素作为最早发现的抗菌肽,也是迄今为止最有效的抗菌肽之一。天蚕素AD(Cecropin AD,CAD)是由天蚕素A的N端第1～11肽段与天蚕素D的C端的第12～37肽段构成的杂合肽,具有较强的抗菌和抗病毒活性。人工合成的杂合肽天蚕素AD其性能明显优于天然抗菌肽,因此被广泛应用于饲料添加剂和食品防腐剂中。目前多采用化学合成的方式得到CAD,但其合成工艺过于复杂繁琐,成本过高,因此利用基因工程技术实现天蚕素AD的高效表达并实现其工业化生产变得十分重要。本试验基于实验室前期构建的p SZHG6R-Xyn B表达载体,成功筛选获得了天蚕素基因单拷贝和双拷贝的黑曲霉重组生产菌株,并尝试通过发酵条件的优化,以寻找提升分泌表达产量的有效方案,同时对所得蛋白进行了抗菌效果和生物学性质的检测。主要结果如下:1.通过重叠延伸PCR技术扩增出带有限制性内切酶NheⅠ、HindⅢ酶切位点的单拷贝CAD基因和双拷贝CAD基因,将其与含有相同酶切位点的载体p SGH6R连接,构建黑曲霉表达载体p SGH6R-CAD、p SGH6R-(CAD)。2.采用冻融法将黑曲霉表达载体p SGH6R-CAD、p SGH6R-(CAD)转化到农杆菌AGL1中,并使用农杆菌介导法转化黑曲霉TH-2,提取菌丝基因组进行PCR鉴定,得到黑曲霉重组菌株。3.将获得的重组纯合菌株摇瓶发酵,收集4～11 d的上清液,利用Tricine-SDS-PAGE小分子蛋白胶鉴定发酵产物,检测到一条分子量约为3.9k D条带,且双拷贝重组菌株的蛋白含量明显高于单拷贝重组菌株。CAD的实际理论分子量为3950.73Da,试验所得分子量大小与理论基本相符。4.对发酵培养基的碳源及初始p H进行了条件优化,以麦芽糖、可溶性淀粉与葡萄糖作为发酵培养基的唯一碳源,试验结果证明发酵培养基中的最佳碳源为葡萄糖,且初始p H值为6.0时,其抗菌效价是8.94×10 U/L,抑菌作用最佳。***对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌及枯草芽孢杆菌均有抑菌活性,对革兰氏阴性菌的抑制作用优于革兰氏阳性菌。***的耐高温性较强,将其100℃水浴3 h之后仍保持活性。CAD对蛋白酶的抵抗力也很强,用蛋白酶处理之后,其抗菌作用只有轻微抑制。通过溶血性试验检测,CAD显示出非溶血特性。综上,本试验在完成黑曲霉表达载体构建的基础上,通过农杆菌介导法将其转化至黑曲霉并筛选获得了重组菌株,对得到的纯合菌株的发酵产物进行了检测及优化了发酵条件,获得了能够稳定遗传的纯合黑曲霉。本研究利用基因工程技术在黑曲霉中成功表达CAD,为其在动物养殖、食品及医药行业的应用提供潜在可能。本研究结果将为生产人工抗菌肽提供新的途径,为安全高效地生产重组蛋白提供新的表达系统。