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多重pcr方法鉴定5类牛源致泻性大肠埃希菌

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中国兽医学报 2024年第1期44卷 107-112,120页

作者：熊昊飞张理坤程璐尚远昊冯玉树李冰慧李勤凡张仕强王妍西北农林科技大学动物医学学院陕西杨凌712100

为建立鉴定5类牛源致泻性大肠埃希菌(DEC)多重pcr检测方法,对陕西关中奶牛场犊牛粪便中分离的大肠埃希菌进行检测。以EAEC(astA、aggR、pic)、EHEC(stx1、stx2)、EPEC(escV、bfpB)、EIEC(invE)和ETEC(lt、stp、sth)5类DEC中11种毒力基因为目标,uidA基因为阳性对照,建立两体系(体系Ⅰ和Ⅱ)多重pcr检测方法,通过改变引物浓度、退火温度等检测条件进行优化,并对其特异性和灵敏度进行检测。结果显示,体系Ⅰ检测EAEC、EHEC,体系Ⅱ检测EPEC、EIEC、ETEC,除astA引物浓度为0.5μmol/L,其余均为0.3~0.4μmol/L;退火温度以59℃最佳;ETEC的检测下限最低(1.09×10^(3)CFU/mL),其余依次为EHEC(1.27×10^(3) CFU/mL)、EIEC(2.43×10^(3) CFU/mL)、EPEC(5.71×10^(3) CFU/mL)、EAEC(7.98×10^(3) CFU/mL);经验证该方法只对DEC毒力基因产生特异性,而对沙门菌、化脓隐秘杆菌、变形杆菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、金黄葡萄球菌不产生特异性条带;应用此方法对183株犊牛腹泻源***进行了检测,共检出17株DEC,其中EAEC 6株、ETEC 4株、EPEC 4株、EHEC 2株、EIEC 1株,经单一pcr验证结果一致。本研究建立的检测5类DEC多重pcr方法可对样品采用两体系、同一pcr反应程序进行检测。该方法的建立为牛源DEC中常见毒力基因的检测及分子流行病学调查提供了方法与借鉴。

关键词：致泻性大肠埃希菌多重pcr 毒力基因犊牛腹泻

一种基于多重pcr的基孔肯雅病毒全基因组高通量测序方法的建立

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中华预防医学杂志 2024年第4期58卷 489-496页

作者：苏文哲李岩陆维智谢华萍李魁彪狄飚聂凯王环宇张周斌许松涛广州市疾病预防控制中心病毒免疫部广州510440 山东省疾病预防控制中心传染病防制所济南250000 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京102206 广州市疾病预防控制中心主任室广州510440

目的:建立基于多重pcr的基孔肯雅病毒全基因组高通量测序方法。方法:通过NCBI网站检索和下载CHIKV的各基因型序列,经序列比对筛选出备选参考序列,使用Primalscheme和Geneious Prime等软件进行引物方案的设计、筛选和人工优化,并使用7份C... 详细信息

目的:建立基于多重pcr的基孔肯雅病毒全基因组高通量测序方法。方法:通过NCBI网站检索和下载CHIKV的各基因型序列,经序列比对筛选出备选参考序列,使用Primalscheme和Geneious Prime等软件进行引物方案的设计、筛选和人工优化,并使用7份CHIKV阳性样品对实验流程进行评估。结果:本研究所设计的引物方案可对各阳性样品进行成功扩增;在样品Ct值小于33时,可获得完整编码区序列;样品Ct值达到35时,可获得99.38%的编码区序列;使用多次迭代,逐步校正的拼接策略可将拼接成功率提高5.70%~25.43%。结论:建立的基于多重pcr的基孔肯雅病毒全基因组高通量测序方法操作简单,对多个浓度的基孔肯雅病毒阳性临床样品均表现良好。

关键词：基孔肯雅病毒全基因组测序多重pcr 高通量测序

11种致牛腹泻病原一步法多重pcr/RT-pcr检测方法的建立

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微生物学通报 2024年

作者：金美君胡云皓辛凌翔刘燕潘瑶王秀丽赵浩然汤承陈曦李锦铨朱良全中国兽医药品监察所华中农业大学四川省甘孜藏族自治州畜牧业科学研究所西南民族大学

【背景】单病原或多病原混合感染导致的牛腹泻综合征严重制约养牛业发展，病原快速准确诊断是防控该病的重要前提。【目的】建立11种致牛腹泻的细菌或病毒病原一步法多重pcr/RT-pcr检测方法，实现快速诊断病原。【方法】通过文献检索，... 详细信息

【背景】单病原或多病原混合感染导致的牛腹泻综合征严重制约养牛业发展，病原快速准确诊断是防控该病的重要前提。【目的】建立11种致牛腹泻的细菌或病毒病原一步法多重pcr/RT-pcr检测方法，实现快速诊断病原。【方法】通过文献检索，调查了引起牛腹泻病的主要病原及其高覆盖率的引物，选择以产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens） α-toxin、肠道沙门氏菌（Salmonella enterica） invA、大肠杆菌（Escherichia coli） K99、牛肠道病毒（BEV） 5′-UTR、牛星状病毒（BAstV） ORF1a、牛轮状病毒（BRoV） VP6、牛嵴病毒（BKoV） D4、牛诺如病毒（BNoV） ORF1、牛冠状病毒（BCoV） N、牛环曲病毒（BToV） N、牛病毒性腹泻黏膜病病毒（BVDV） 5′-UTR为靶标序列的引物，通过温度梯度pcr及单一控制变量法优化退火温度、引物浓度、循环数，建立11种病原的多重pcr/RT-pcr检测方法，对该方法进行了特异性、灵敏度和重复性评价，并应用该方法进行临床样品检测。【结果】最佳退火温度为54.4 ℃，C. perfringens、S. enterica、E. coli K99、BEV、BAstV、BRoV、BKoV、BNoV、BCoV、BToV和BVDV对应基因片段最优引物浓度分别为0.2、0.25、0.25、0.2、0.25、0.25、0.35、0.5、0.25、0.25、0.3 μmol/L，最优循环数为35个循环。该方法特异性强，仅对靶标病原检测为阳性，对溶血性曼氏杆菌（Mansiella haemolyticus）、化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）、牛支原体（Mycoplasma bovine）分离株等病原检测均为阴性；敏感性高，对重组质粒标准品最低检出限依次为7.5×103、7.5×104、7.5×103、7.5×101、7.5×104、7.5×102、7.5×103、7.5×102、7.5×102、7.5×104、7.5×103copies/μL；重复性好，批间与批内试验均一致。用该方法检测江苏地区临床样品490份，结果显示，BEV、BAstV、BRoV、BKoV、BNoV、BCoV、BToV、BVDV阳性率分别0.61%、0.41%、0.61%、0.21%、27.14%、3.27%、0.21%、1.02%。通过单重pcr对该多重pcr临床样品检测结果进行重复验证，结果显符合率为100%。随机挑选50个检测为阳性的pcr产物进行测序验证，结果均为相应病原的基因片段。【结论】成功建立一种同时检测11种牛腹泻主要病原的一步法多重pcr/RT-pcr检测方法。

关键词：牛腹泻细菌病毒多重pcr RT-pcr

鰤鱼诺卡氏菌多重pcr 分型方法的建立与应用

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大连海洋大学学报 2024年

作者：李雨豪陈宝鑫费晴林冠英黄婷夏立群广东海洋大学水产学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室广东海洋大学深圳研究院广东省水生动物健康评估工程技术研究中心深圳海水经济动物种苗健康评价公共技术服务平台广西壮族自治区水产科学研究院广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室

为建立一种鰤鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolae）多重pcr的分型方法，对已公布的20个鰤鱼诺卡氏菌全基因组数据进行对比分析，筛选鰤鱼诺卡氏菌种内差异基因片段并设计pcr引物，经单重pcr验证确认后进行引物组合、引物配比优化，构建鰤鱼... 详细信息

为建立一种鰤鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolae）多重pcr的分型方法，对已公布的20个鰤鱼诺卡氏菌全基因组数据进行对比分析，筛选鰤鱼诺卡氏菌种内差异基因片段并设计pcr引物，经单重pcr验证确认后进行引物组合、引物配比优化，构建鰤鱼诺卡氏菌的多重pcr菌株分型方法，并对该菌株分型方法进行灵敏度分析和病例应用。结果表明：在实验中构建的多重pcr菌株分型方法可用于鰤鱼诺卡氏菌培养物和感染鱼样分型，并确认鰤鱼诺卡氏菌ArsC、AraC、ISOPREN、ALAT、IclR基因片段具有种内差异；其中多重pcr引物组合①（ISOPREN-F/R、ALAT-F/R、IclR -F/R）引物最优配比为ISOPREN-F/R:ALAT-F/R:IclR-F/R=2:1:2，灵敏度达125 pg/μL，组合②（AraC-F/R、ALAT-F/R、IclR-F/R）引物最佳配比为AraC-F/R:ALAT-F/R:IclR-F/R=1:1:1，灵敏度达500 pg/μL，组合③（ArsC-F/R、ALAT-F/R、IclR-F/R）引物最佳配比为ArsC-F/R:ALAT-F/R:IclR-F/R=1:2:2，灵敏度达500 pg/μL。研究表明，本研究中建立的鰤鱼诺卡氏菌的多重pcr菌株分型方法，可在1-2小时内完成鰤鱼诺卡氏菌的菌株分型鉴定，为水产实践中鰤鱼诺卡氏菌感染病例的菌株分型提供快速、准确、实用的鉴定方法，可助力于鱼类诺卡氏菌病的防控。

关键词：鰤鱼诺卡氏菌多重pcr 菌株分型

鉴别6种常见食用肉类的多重pcr检测体系的构建及验证

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法医学杂志 2024年第3期40卷 254-260页

作者：蒋志伟夏若成陶瑞旸李成涛温州医科大学基础医学院法医学系浙江温州325035 司法鉴定科学研究院上海市法医学重点实验室司法部司法鉴定重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台上海200063

目的建立一种快速、准确、灵敏的多重pcr检测方法,用于同时鉴别6种常见食用肉类(牛、羊、鸡、猪、鹅、鸭),并评估其在肉类食品掺假鉴定中的应用价值。方法基于GenBank数据库中6个物种的线粒体全基因组序列,筛选具有种内保守性、种间特... 详细信息

目的建立一种快速、准确、灵敏的多重pcr检测方法,用于同时鉴别6种常见食用肉类(牛、羊、鸡、猪、鹅、鸭),并评估其在肉类食品掺假鉴定中的应用价值。方法基于GenBank数据库中6个物种的线粒体全基因组序列,筛选具有种内保守性、种间特异性的DNA序列(牛16S rRNA、羊COX-1、鸡Cytb、猪COX-1、鹅NADH2、鸭16S rRNA),并设计物种特异性引物,以此构建一个可同时鉴别6种常见食用肉类的多重pcr检测体系。对该体系进行种属特异性、灵敏度和重复性研究,并进行模拟混合样品检测。结果成功构建了一个可同时鉴别6种常见食用肉类的多重pcr检测体系,该体系在非目标物种的DNA中均未有效扩增;在DNA模板量为0.0625~2ng/μL时,6个物种的扩增产物均能检见。在鸭肉和牛肉混合比例低至0.5%时,仍能检测到鸭肉成分。结论本研究构建了一个特异性强、灵敏度高、重复性好的多重pcr检测体系,可准确鉴别6种常见食用肉类食品中的动物源性成分,为我国常见食用肉类及肉制品的掺假鉴定提供了一种简单、实用的检测技术。

关键词：法医物证学线粒体DNA 多重pcr 种属鉴定食用肉类

4种食源性致病菌多重pcr检测体系的建立及其在乳品检测中的应用

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中国乳品工业 2024年第1期52卷 47-52页

作者：王珊高辉明王雁伟周思思庞艳荣艾鹏飞河北科技大学食品与生物学院石家庄050018

食源性致病菌是通过食物进入人体引起食物中毒和诱发疾病的有害微生物,严重威胁着人类健康和环境安全,为了预防和控制食源性疾病的发生,有效对策之一是对食品中的病原微生物进行安全检测。本研究采用一种多重聚合酶链式反应法(multiplex... 详细信息

食源性致病菌是通过食物进入人体引起食物中毒和诱发疾病的有害微生物,严重威胁着人类健康和环境安全,为了预防和控制食源性疾病的发生,有效对策之一是对食品中的病原微生物进行安全检测。本研究采用一种多重聚合酶链式反应法(multiplex polymerase chain reaction,Mpcr)快速检测乳品中4种食源性致病菌,结果表明,选取单核细胞增生李斯特氏菌prfA基因、蜡样芽胞杆菌gyrB基因、鼠伤寒沙门氏菌invA基因、大肠埃希氏菌O157∶H7 stx2A基因的保守序列设计4对引物,在优化的pcr反应体系和退火温度58℃下,pcr扩增表现出良好的特异性,分别扩增出274、221、482、108 bp条带,无非特异性扩增,4种病原菌检出限达到10~100 CFU/mL;对17份人工染菌牛奶样品进行检测,检出结果与国标培养法完全一致。该研究结果为快速、高效、准确地检测出乳品中单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157∶H7提供了一种实用方法,也为其他食源性致病菌的快速检测提供了思路。

关键词：多重pcr 食源性致病菌检测

PCV2a、PCV2b和PCV2d多重pcr检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2024年第7期54卷 896-904页

作者：谭健梅赵雨欣黄艳玲周小汇陈媛雷磊罗施乐郝裕波杜红梅雷红宇苏建明王乃东湛洋湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128 兽用蛋白质工程疫苗湖南省重点实验室湖南长沙410128 湖南派智生物科技有限公司湖南长沙410205 常德市畜牧水产事务中心湖南常德415000

为了建立一种能够快速鉴别PCV2a、PCV2b和PCV2d的方法,本研究针对PCV2a、PCV2b和PCV2d这3个基因型分别设计3组特异性引物,通过构建阳性标准质粒,筛选出最适引物组合,建立了一种PCV2分型的多重pcr检测方法,并对该方法进行优化后,开展特... 详细信息

为了建立一种能够快速鉴别PCV2a、PCV2b和PCV2d的方法,本研究针对PCV2a、PCV2b和PCV2d这3个基因型分别设计3组特异性引物,通过构建阳性标准质粒,筛选出最适引物组合,建立了一种PCV2分型的多重pcr检测方法,并对该方法进行优化后,开展特异性、灵敏度、重复性试验以及临床样品检测。结果显示,利用筛选出的最适引物组合建立了多重pcr检测方法,能特异性扩增出3个目的条带:PCV2a(321bp)、PCV2b(190 bp)和PCV2d(561 bp),探索出最佳退火温度和循环数分别为60℃和25个,与其他病原(PPV、PRV、PEDV、TGEV、PRRSV、CSFV)无交叉反应;对构建的阳性标准质粒的最低检测拷贝数为103copies;同一模板的3次重复性试验结果一致;检测2个猪场流行的PCV2基因型毒株,并通过测序和进化分析进一步验证了该检测方法的准确性。结果表明,本研究建立的多重pcr检测方法有助于开展PCV2a、PCV2b和PCV2d的快速鉴别诊断,为PCV2的防控以及流行病学研究提供了技术支持。

关键词： PCV2a PCV2b PCV2d 共感染多重pcr

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H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV多重pcr检测方法的建立及应用

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中国动物传染病学报 2024年第1期32卷 135-141页

作者：徐毅余良政林霜任同伟王豪曾昊郭嘉宁郭金凡黄崇强欧阳康黄伟坚韦祖樟陈樱广西大学动物传染病与分子免疫学实验室广西大学动物科学技术学院南宁530004

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染肺泡巨噬细胞,严重损害免疫系统,导致与其他病毒共感染现象,其中猪流感病毒(SIV)也是病原之一。为了快速检测和区分PRRSV基因型与SIV亚型,本研究针对H1、H3亚型SIV的HA基因和美洲型、欧洲型PRRSV的N、... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染肺泡巨噬细胞,严重损害免疫系统,导致与其他病毒共感染现象,其中猪流感病毒(SIV)也是病原之一。为了快速检测和区分PRRSV基因型与SIV亚型,本研究针对H1、H3亚型SIV的HA基因和美洲型、欧洲型PRRSV的N、M基因的保守序列,分别设计了4对特异性扩增引物,在引物浓度、退火温度等反应条件的系统优化下,分别对其特异性和敏感性进行验证,建立了能够快速检测以上4种病原的多重pcr方法,并对155份临床样品进行了检测。结果显示,该检测方法特异性好、灵敏度高,对H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV的最低检出量均低至9.86×10^(0) copies/μL。以单一pcr方法对所有临床样品进行检测后发现,检测结果与多重pcr检测结果一致,证明这种多重pcr方法可以用于这4种病毒的快速检测与分型鉴定。

关键词：猪流感病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒多重pcr

BVDV、IBRV和AKAV多重pcr检测方法的建立与应用

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中国兽医学报 2024年第1期44卷 39-43,87页

作者：鲍显伟李昊李小龙石亚楠王雪妍许立华宁夏大学动物科技学院宁夏银川750021

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)和阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)是引起牛发生繁殖障碍性传染病的主要病原。本研究根据BVDV的5′-UTR、IBRV的gB基因和AKAV的S基因设计了3对特异性引物,构建了检测BVDV、IBRV和AKAV的多重pcr方法,并优化反应体系和条件,验证了该方法的特异性和敏感性。结果显示,构建的多重pcr方法对其他牛源病毒无扩增,对BVDV、IBRV和AKAV的最低检测限分别为10^(3)、10^(3)和10^(4)拷贝/μL。对采集的184份临床血清样品进行检测,BVDV、IBRV和AKAV的阳性率分别为18.48%、14.13%和1.63%,BVDV和IBRV 2种病原混合感染的阳性率为3.8%,BVDV和AKAV两种病原混合感染的阳性率为1.63%。该结果与我国出入境检疫行业标准符合率达92%以上,BVDV+IBRV和BVDV+AKAV混合感染的符合率为100%。表明本研究建立的多重pcr检测方法可用于临床样品的检测。BVDV、IBRV和AKAV多重pcr检测方法的建立,为我国牛群BVD、IBR和AKA的检测和流行病学调查提供了一种快捷简便的分子生物学检测方法。

关键词：牛病毒性腹泻病毒牛传染性鼻气管炎病毒阿卡斑病毒多重pcr