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口蹄疫病毒结构蛋白VP3形成二聚/多聚体关键区域的鉴定及其免疫效果评价

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口蹄疫病毒结构蛋白VP3形成二聚/多聚体关键区域的鉴定及其免疫效...

作者：亢伟芳中国农业科学院

学位级别：硕士

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)感染偶蹄动物引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。FMDV有七个血清型,各血清型之间无交叉保护反应,这给FMD的诊断和预防造成了极大困难。FMD... 详细信息

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)感染偶蹄动物引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。FMDV有七个血清型,各血清型之间无交叉保护反应,这给FMD的诊断和预防造成了极大困难。FMDV的衣壳蛋白对FMDV发挥抗原性和免疫原性起决定性作用。其中VP3蛋白上具有多段抗原决定簇,可以诱导宿主产生免疫应答,因此也是FMDV基因工程疫苗的候选抗原。此外,大量研究表明病毒蛋白多聚体的形成不仅影响病毒结构的稳定性,对抗原性和免疫原性也起着重要作用,因此在病毒疫苗研发中受到极大的关注。前期的研究发现FMDV感染PK-15细胞后会出现聚集体,但是FMDV VP3蛋白是否形成多聚体、形成多聚体的关键区域以及关键区域免疫原性效果还不是很清楚。针对以上问题,该课题将从以下三个方面进行研究:1.FMDV VP3蛋白自身互作的验证:本研究首先构建了含不同标签的VP3真核表达质粒,共转染293T细胞,通过激光共聚焦试验发现两种不同标签的VP3蛋白在细胞胞浆中存在共定位现象,并结合免疫共沉淀试验初步验证了VP3蛋白之间可以发生相互作用,进一步通过GST-Pull down试验证实了VP3蛋白自身可以发生直接相互作用。2.FMDV VP3蛋白形成二聚/多聚体及关键区域的鉴定:为了探究FMDV VP3蛋白是否能够形成多聚体,本研究应用高效液相色谱分析发现原核表达的VP3蛋白在缓冲液中主要以二聚体和单体形式存在,通过非变性凝胶电泳发现在FMDV感染状态下内源性VP3蛋白也存在多聚体形式。随后利用VP3截短体和半胱氨酸突变体证实VP3蛋白形成二聚/多聚体主要依赖于111-220aa之间的肽段,且二聚体的形成与VP3蛋白上的二硫键无关。3.FMDV VP3及其截短体蛋白免疫原性评价与分析:为了进一步探究VP3蛋白形成多聚体的关键区段对蛋白本身抗原性和免疫原性的影响,本研究通过原核表达系统表达了VP3截短体及其全长蛋白,选用弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂乳化蛋白对豚鼠进行免疫,通过病毒中和试验和ELISA试验评估了VP3各段蛋白的免疫效果。结果表明VP3-(1-110 aa)区段与VP3-(111-220 aa)区段产生的特异性Ig G、IFN-γ、中和抗体水平在一免以后略低于全长VP3蛋白,而二免以后三者之间无显著性差异。由此推测VP3蛋白发生多聚化的区域同样具有抗原表位,可以对豚鼠产生免疫保护。综上所述,本研究证实了VP3蛋白之间能够发生直接相互作用形成多聚体,明确了VP3蛋白之间发生相互作用的区段是111-220 aa,并且该区段同样可以诱导机体的免疫反应,这为口蹄疫基因工程苗的研发和病毒体外组装奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒 VP3 二聚体多聚体免疫原性

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多聚体在生物钟振子中的作用

多聚体在生物钟振子中的作用

作者：马海艳苏州大学

学位级别：硕士

生物钟主要指生物体生理和行为适应环境因子呈昼夜周期性变化的一种内在机制。这些以24小时为周期性变化的生理现象本质上是细胞内一些蛋白浓度呈周期性变化的结果。因此我们可以通过建立微分方程来描述这些蛋白浓度的变化,继而研究生... 详细信息

生物钟主要指生物体生理和行为适应环境因子呈昼夜周期性变化的一种内在机制。这些以24小时为周期性变化的生理现象本质上是细胞内一些蛋白浓度呈周期性变化的结果。因此我们可以通过建立微分方程来描述这些蛋白浓度的变化,继而研究生物钟问题。本论文则基于哺乳动物生物钟多聚体数学模型,采用交支研究的方法来探索多聚体在生物钟振子中的作用。研究方法包括:（1）数学建模;（2）时滞微分方程Hopf分支分析;（3）数值仿真实验。本文工作主要集中在如下三部分:（1）建立哺乳动物生物钟系统转录调控的多聚体数学模型生物钟系统本质上是由时钟基因以及自主调控的环路构成,本文则在哺乳动物生物钟基因关系调控图精简的基础上,建立时滞微分方程来描述生物钟基因构成的负反馈调控机制,从数学层面上研究生物钟系统的动力学行为。（2）基于时滞微分方程分支理论来探索多聚体在生物钟振子中的作用在生物钟系统中,带有时滞的负反馈调控环是系统产生振荡的重要机制,基于哺乳动物生物钟多聚体数学模型,利用时滞微分方程Hopf分支分析方法,结合数学理论证明了单聚体不能使生物钟系统产生振荡;并进一步证明了生物钟系统中聚体的聚合数越多,系统的振荡越鲁棒。（3）数值模拟仿真结合生物现象对照说明以上结论的正确性最后,利用Matlab软件从数值实验层面上对本文在探索多聚体在生物钟振子中的作用得出的相关结论进行验证,进一步说明结论的正确性,并对相关结果在生物学层面上给出合理的解释。本文研究多聚体在生物钟振子中的作用,本质上是研究参数变化对系统稳定性的影响,在一定程度上阐明了生物钟振子振荡鲁棒性的一个工作机制,并为人工合成生物学振子提供了新思路。

关键词：生物钟时间延滞 Hopf分支多聚体鲁棒性

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中华医学杂志 2018年第34期98卷 2773-2775页

作者：杨乔赵彧墨吴东中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院消化内科 100730

获得性血管性血友病综合征（AvWS）是一类出凝血障碍性疾病，由继发性的血管性血友病因子（vWF）结构或功能障碍导致。患者常表现为不明原因的消化道出血，病因易被忽视，或被误诊为血管性血友病（vWD）。

关键词：获得性血管性血友病综合征血流动力学异常高分子量血管性血友病因子多聚体 vWF 凝血障碍性疾病消化道出血

减少重组蛋白TP25在Protein L层析中形成多聚体方法的建立

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中国生物制品学杂志 2019年第7期32卷 794-797,802页

作者：展波高星星曹强庚彭延杰山东省生物制品研究所研发中心山东泰安271000 山东第一医科大学第二附属医院山东泰安271000 山东省妇幼保健院国家生育调控技术重点实验室山东济南250000

目的建立减少重组蛋白TP25在ProteinL层析中形成多聚体的方法。方法通过在ProteinL层析纯化重组蛋白TP25使用的洗脱缓冲液中添加半胱氨酸(L-cysteine,Cys)等保护剂,并采用碱性溶液中和洗脱液的方法优化多聚体去除条件,经非还原SDS-PAGE... 详细信息

目的建立减少重组蛋白TP25在ProteinL层析中形成多聚体的方法。方法通过在ProteinL层析纯化重组蛋白TP25使用的洗脱缓冲液中添加半胱氨酸(L-cysteine,Cys)等保护剂,并采用碱性溶液中和洗脱液的方法优化多聚体去除条件,经非还原SDS-PAGE检测纯化过程中目的蛋白多聚体的变化情况,葡聚糖凝胶SephadexG25层析去除洗脱液中Cys。结果去除ProteinL层析形成多聚体的最适条件为:用含Cys终浓度为100mmol/L的20mmol/L柠檬酸溶液进行直接洗脱,并经0.5mmol/L的NaOH溶液中和。该条件下纯化的目的蛋白纯度可达95%以上,且多聚体含量大幅减少。葡聚糖凝胶SephadexG25可有效去除半胱氨酸。结论在洗脱液中添加Cys可有效减少重组蛋白TP25在ProteinL层析纯化过程中多聚体的形成。

关键词：重组蛋白 Protein L层析 L-半胱氨酸多聚体

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生长抑素及制剂中多聚体的定量研究

中国药品标准 2023年第6期24卷 596-600页

作者：张伟张慧梁成罡中国食品药品检定研究院激素室国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室北京102629

目的:建立高效液相色谱-分子排阻色谱法(HPLC-SEC)测定生长抑素及制剂中的多聚体,并进行了方法学验证。方法:采用TSKgel G2000SWXL色谱柱(7.8 mm×300 mm,5μm),流动相为乙腈-水-三氟乙酸(20∶80∶0.1,体积比),线性等度洗脱,流速0.5 mL... 详细信息

目的:建立高效液相色谱-分子排阻色谱法(HPLC-SEC)测定生长抑素及制剂中的多聚体,并进行了方法学验证。方法:采用TSKgel G2000SWXL色谱柱(7.8 mm×300 mm,5μm),流动相为乙腈-水-三氟乙酸(20∶80∶0.1,体积比),线性等度洗脱,流速0.5 mL·min^(-1),柱温25℃,进样量为100μL;紫外检测器,检测波长为215 nm;标准曲线法和面积归一化法计算多聚体含量。结果:生长抑素二聚体的检测限为5.2 ng,定量限为15.6 ng,线性范围为0.1~5μg·mL^(-1)(r=0.999 6),平均回收率(n=3)为100.3%(RSD=0.52%)。结论:该方法快速、灵敏、准确,能够对生长抑素及制剂中的多聚体进行质控。

关键词：高效液相色谱-分子排阻色谱法紫外生长抑素制剂多聚体

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pMHC多聚体技术研究进展

中国免疫学杂志 2018年第3期34卷 472-477页

作者：董帅郑红俊钟时广州市香雪制药股份有限公司广州510530

抗原肽结合的主要组织相容性复合物(pMHC)通过形成多聚体可有效提高结合到位于T细胞表面上的T细胞受体(TCR)的亲合力。自从20年前pMHC四聚体首次被用于抗原特异性T细胞检测以来,pMHC四聚体已成为免疫分析中最重要的检测工具之一。近年来... 详细信息

抗原肽结合的主要组织相容性复合物(pMHC)通过形成多聚体可有效提高结合到位于T细胞表面上的T细胞受体(TCR)的亲合力。自从20年前pMHC四聚体首次被用于抗原特异性T细胞检测以来,pMHC四聚体已成为免疫分析中最重要的检测工具之一。近年来pMHC多聚体在四聚体的基础上又取得了较大进展,更高价的pMHC多聚体被研制出来以提高免疫检测的灵敏度;可逆化的pMHC多聚体由于可以从T细胞表面解离而避免了对T细胞的功能损伤,也被发展用于抗原特异的T细胞分离。pMHC多聚体作为一类分子工具在抗原特异的T细胞分析和免疫治疗中具有重要作用,对它的充分了解和有效运用能帮助我们更好地进行科学和临床应用。

关键词： MHC 四聚体多聚体 TCR 免疫治疗

TgDLC8a-GST多聚体蛋白复合物表达载体的构建及其在鸡球虫疫苗上的应用

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TgDLC8a-GST多聚体蛋白复合物表达载体的构建及其在鸡球虫疫苗上...

作者：霍子云山东农业大学

学位级别：硕士

同源二聚体是生物蛋白质较常见的存在形式。两种同源二聚体蛋白可以形成多聚体复合物。可广泛应用于多种领域,其中一个非常重要的应用是可以用作抗原表达平台,用来插入抗原表位,来提高抗原的载量。本研究利用弓形虫的动力蛋白轻链8a(TgD... 详细信息

同源二聚体是生物蛋白质较常见的存在形式。两种同源二聚体蛋白可以形成多聚体复合物。可广泛应用于多种领域,其中一个非常重要的应用是可以用作抗原表达平台,用来插入抗原表位,来提高抗原的载量。本研究利用弓形虫的动力蛋白轻链8a(TgDLC8a)和谷胱甘肽S转移酶(GST)这两个同源二聚体表达形成多聚体复合物,作为一个疫苗表达平台,插入鸡艾美尔球虫的多种抗原片段。以带有GST标签的PGEX-6P-1为载体,通过基因工程技术将TgDLC8a基因克隆至PGEX-6P-1载体上,利用PGEX-6P-1携带的GST蛋白完成与TgDLC8a的融合。为了展示抗原,选取GST与TgDLC8a基因之间的BamHI和对TgDLC8a蛋白空间结构影响较小部位(37-42 bp)两个位置作为抗原的插入位点,构建多聚表达载体TgDLC8a-GST。将柔嫩艾美尔球虫抗原EtMIC2、EtMIC1H的关键结构域克隆到TgDLC8a-GST载体上,利用诱导表达的多价抗原复合物对该表达平台进行评价。TgDLC8a-GST转BL21诱导表达产物经Native-PAGE和Western-blot分析表明,融合的TgDLC8a-GST同源二聚体可以形成多聚体复合物。抗原基因克隆至重组表达载体后均可成功表达并形成蛋白二聚体及多聚体,表明TgDLC8a插入的酶切位点不影响其同源二聚体的形成,该平台可以用于疫苗展示。研究表明TgDLC8a和GST融合成的同源二聚体可以形成多聚复合物。本研究成功构建了重组多聚体表达平台(TgDLC8a-GST),该平台可以高效地以多价态的形式展示抗原,为基因工程疫苗的研发提供了良好平台。利用鸡球虫感染试验对该重组疫苗株的免疫保护效果进行了探究。140只一日龄雏鸡随机平均分成7组,I、II组为PBS对照组,III、IV、V、VI、VII组动物分别皮下多点免疫TgDLC8a-GST蛋白抗原疫苗、TgDLC8a-GST-MIC2-MIC1H蛋白抗原疫苗、TgDLC8a-GST-MIC2-MIC1H蛋白抗原疫苗(辅助佐剂)、EtMIC2、EtMIC1H混合蛋白抗原疫苗、EtMIC2、EtMIC1H混合蛋白抗原疫苗(辅助佐剂)。21日龄时,对II、III、IV、V、VI、VII组口服接种16000个E.tenella孢子化卵囊。31日龄时,对结果进行分析。动物试验结果表明,IV、V、VI、VII组蛋白抗原疫苗均能够对球虫的感染提供一定的保护作用,且IV组平台表达疫苗株与VI组比较要有效。

关键词：多聚体 TgDLC8a-GST多聚表达载体基因工程疫苗

GRPR受体拮抗剂RM26多聚体的18F标记和生物性质研究

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GRPR受体拮抗剂RM26多聚体的18F标记和生物性质研究

作者：吕敏丽西南医科大学

学位级别：硕士

目的:肿瘤细胞与正常细胞具有明显不同的生物学特征,多种肿瘤细胞过度表达的胃泌素释放肽受体(Gastrin Releasing Peptide Receptor,GRPR),靶向GRPR拮抗剂RM26较激动剂具有较好的优势,因此GRPR拮抗剂类似物成为高表达GRPR的肿瘤靶向诊... 详细信息

目的:肿瘤细胞与正常细胞具有明显不同的生物学特征,多种肿瘤细胞过度表达的胃泌素释放肽受体(Gastrin Releasing Peptide Receptor,GRPR),靶向GRPR拮抗剂RM26较激动剂具有较好的优势,因此GRPR拮抗剂类似物成为高表达GRPR的肿瘤靶向诊断和放射性治疗的研究热点。单体RM26小分子多肽在体内生物稳定性受限且肿瘤/背景比较差,本文拟通过RM26肽同质多价载体的构思克服单体的缺陷,合成RM26的二聚体,三聚体,用荧光法研究人前列腺癌肿瘤细胞PC-3对不同RM26多聚体的细胞摄取及靶向性质;通过连接螯合剂NOTA,利用AlF络合标记法标记NOTA-[RM26]、NOTA-3P-[RM26]、NOTA-4P-[RM26],探索RM26多聚体在PC-3荷瘤鼠体内的肿瘤摄取和生物分布。方法:(1)用液相合成FITC/NOTA-[RM26]、FITC/NOTA-3P-[RM26]、FITC/NOTA-4P-[RM26],然后使用质谱表征、HPLC确认合成正确的目标化合物及其化学纯度;(2)利用共聚焦显像进行细胞摄取荧光定性实验,流式仪进行细胞摄取荧光半定量实验,MTS法测细胞毒性等,研究单体FITC-[RM26],二聚体FITC-3P-[RM26]、三聚体FITC-4P-[RM26]在PC-3中的细胞摄取能力、特异性靶向能力、细胞毒性;(3)利用AlF络合标记法标记NOTA-[RM26]、NOTA-3P-[RM26]、NOTA-4P-[RM26],探索AlF标记最优条件,建立分离纯化方法,测定各标记产物的放化学纯度以及体外的稳定性;(4)利用SPF BALB/c-n雄性裸鼠建立PC-3荷瘤鼠肿瘤模型用于体内实验,实验组尾静脉注射0.1mL剂量约为100 uCi的AlF-NOTA-[RM26]、AlF-NOTA-3P-[RM26]、AlF-NOTA-4P-[RM26](n=3);对照组注射同等体积及放射剂量的F-FDG(n=3);封闭实验组为预先注射50倍过量未标记BBN封闭5 min,然后注射同等体积及放射剂量的三种标记物(n=3);注射后5 min、30 min、60 min、120min分别进行micro-PET/CT显像,研究单体与不同多聚体在PC-3荷瘤鼠体内肿瘤靶向摄取和体内生物分布;比较实验组、封闭组、对照组之间的差异,初步评价AlF-NOTA-3P-[RM26]、AlF-NOTA-4P-[RM26]用于肿瘤靶向显像诊断、治疗的应用价值。结果:(1)质谱表征确定成功合成目标产物FITC/NOTA-[RM26]、FITC/NOTA-3P-[RM26]、FITC/NOTA-4P-[RM26],经HPLC/UV测定分离纯化后目标产物化学纯度均超过97%。(2)GRPR阳性的PC-3细胞与FITC-[RM26]、FITC-3P-[RM26]、FITC-4P-[RM26]结合速度快,添加带荧光的RM26多聚体15 min后便能清楚地观察到细胞摄取荧光,并且在45 min细胞摄取显著增加;荧光实验结果表明细胞摄取水平为FITC-[RM26]多聚体对PC-3细胞具有特异性靶向能力。(3)AlF络合标记法成功标记NOTA-[RM26]、NOTA-3P-[RM26]、NOTA-4P-[RM26],反应时间为30 min,标记产率为15-20%;经C18柱分离纯化后,三种放射性标记产物的放化纯度均大于95%。将放射性纯度大于95%的三种标记物分别置于室温下PBS、小鼠血清中2 h后,其放化纯度在PBS中均大于95%,在血清中均大于90%。(4)动物PET/CT显像结果表明AlF-NOTA-4P-[RM26]在荷瘤鼠体内肿瘤显像效果最佳,表现出多价优势,与细胞实验结果基本吻合;50倍过量BBN成功封闭肿瘤表面受体,表明RM26多聚体在体内对肿瘤具有特异性靶向能力;同时在动物显像研究结果中表明,三种AlF标记物主要通过肾脏排泄;AlF-NOTA-3P-[RM26],AlF-NOTA-4P-[RM26]在动物体内心脏、腹腔脏器的放射性分布低于F-FDG。结论:拮抗剂RM26多聚体较单体具有多价效应优势,体内外实验表明与单体比较,RM26多聚体明显提高了对GRPR受体的特异性靶向能力,有望发展成为高靶向能力的新型显像剂和放射性治疗性药物。

关键词：胃泌素释放肽受体拮抗剂 RM26 多聚体 micro-PET/CT

重组融合蛋白EGF-E4orf4多聚体的鉴定及结构分析

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中国生物工程杂志 2012年第7期32卷 1-7页

作者：倪蓓蓓范真真陈虹黄秉仁中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的:确认重组融合蛋白EGF-E4orf4为多聚体及其具有EGFR结合活性。方法:通过凝胶过滤层析、SDS-PAGE和免疫印迹分析重组融合蛋白EGF-E4orf4是否形成聚合物。利用动态光散射、静态光散射和圆二色谱测定EGF-E4orf4的分子半径、分子量和二... 详细信息

目的:确认重组融合蛋白EGF-E4orf4为多聚体及其具有EGFR结合活性。方法:通过凝胶过滤层析、SDS-PAGE和免疫印迹分析重组融合蛋白EGF-E4orf4是否形成聚合物。利用动态光散射、静态光散射和圆二色谱测定EGF-E4orf4的分子半径、分子量和二级结构。应用流式细胞术分析EGF-E4orf4与细胞表面EGFR结合能力。结果:凝胶过滤等方法证实EGF-E4orf4形成了多聚体,光散射实验证明了EGF-E4orf4多聚体的分子量和分子半径分别为1.656×107Da、67.90nm,约为820聚体。圆二色谱表明该聚合体融合蛋白含有大量的β-折叠结构。受体结合实验证明该聚合物具有EGFR结合活性。结论:重组融合蛋白EGF-E4orf4以蛋白多聚体形式存在,可以与EGFR结合。因此,EGF-E4orf4作为一种新型靶向性抗肿瘤药物,具有潜在的临床应用前景。

关键词： EGF-E4orf4 多聚体光散射圆二色谱生物学活性