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槟榔叶表微生物富集及基因组DNA提取方法优化

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分子植物育种 2024年

作者：徐芮马瑞芮凯王贞霖杨顺义王宝海南省农业科学院植物保护研究所海南省农业科学院农产品质量安全与标准研究中心海南省植物病虫害防控重点实验室农业农村部海口作物有害生物科学观测实验站甘肃农业大学植物保护学院甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室海南省农业科学院三亚研究院

为获取高质量的基因组DNA用于研究槟榔叶表微生物的群落多样性，采用不同样本量和洗脱液组合对槟榔叶片进行预处理，通过超微量分光光度计、琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增检测对提取的dna进行比较分析。结果显示，不同样本量和洗脱液成分对... 详细信息

为获取高质量的基因组DNA用于研究槟榔叶表微生物的群落多样性，采用不同样本量和洗脱液组合对槟榔叶片进行预处理，通过超微量分光光度计、琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增检测对提取的dna进行比较分析。结果显示，不同样本量和洗脱液成分对基因组DNA的质量有显著影响，其中dna浓度随样本量的增加呈先上升后下降的趋势，当样本量为75 g时达到最大；洗脱液中加入Silwet L-77后获得的dna浓度更大，且纯度高，杂质污染少，明显优于单独使用无菌水或PBS缓冲液作洗脱液时的结果。综合比较，当槟榔叶片样本量在75 g，以无菌水+Silwet L-77作为洗脱液时可以富集到足够的叶表微生物，所提取的基因组DNA浓度为80.80 μg/mL，A260/A280和A260/A230值分别为1.83和2.12，满足后续实验要求，成本最低，为最佳前处理方法。

关键词：槟榔叶表微生物基因组DNA

肠道出血性大肠埃希菌菌株及其基因组DNA标准物质的研制及评价

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中国生物制品学杂志 2023年第7期36卷 833-838页

作者：刘娜王亚萍赵琳娜王学硕崔生辉中国食品药品检定研究院北京100050

目的筛选肠道致病性大肠埃希氏菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)菌株,并将其申报为中国医学细菌保藏管理中心(China Medical Bacterial Species Conservation and Management Center,CMCC)标准菌株;以此标准菌株研制我国自主知识产权的EHEC菌株及其基因组DNA标准物质,并将其申报为国家药品标准物质。方法依据GB4789.6-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》,从160株来源于腹泻患者的大肠埃希菌中筛选EHEC菌株,按照CMCC菌株管理规定整理材料将其申报为标准菌株。用其制备EHEC菌液及其基因组DNA溶液,采用冷冻干燥技术分别制备菌株类(103CFU/样品)和基因组DNA类(20 ng/样品)样品各600个。将这两种样品各随机抽取20个进行均匀性检验;并分别于25、37℃条件下存放1、3、5、7 d取样检测运输稳定性,于4℃条件下存放7、14、28 d取样检测短期保存稳定性,于-20℃条件下存放14、28、60 d取样检测长期保存稳定性。组织3家实验室对两种样品进行协同标定。筛选20种食品基质对菌株样品进行使用效果评价。结果从160株来源于患者的大肠埃希菌中筛选出1株EHEC菌株,最终申报为CMCC(B)43207标准菌株。均匀性检验中,F_(菌株样品)=0.662 0.05;20个基因组样品的eae、stx1、stx2基因均为阳性。于25和37℃保存7 d、-20℃保存60 d、4℃保存28 d后,菌株样品活菌含量均为10^(3)CFU/样品,基因组样品的eae、stx1、stx2基因均为阳性。随机抽取的EHEC菌株和基因组DNA样品经3家实验室鉴定均为EHEC,活菌含量均在10^(3)CFU/样品的水平,且eae、stx1、stx2基因均为阳性。在20种食品基质中加入样品后均可检出,本底对照均未检出。EHEC菌株及其基因组DNA样品均纳入我国药品标准物质,编号分别为80024和80056。结论研制的具有自主知识产权的EHEC菌株及其基因组DNA标准物质可提高EHEC检验的时效性,弥补了我国此方面空白。

关键词：微生物标准物质肠道致病性大肠埃希菌基因组DNA

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直立白薇基因组DNA提取条件的优化

北方园艺 2023年第21期 109-115页

作者：崔立娟李洁李欣培王焜佳张珂璠徐凌川山东中医药大学药学院山东济南250307

以新鲜直立白薇叶片为试材,采用dna试剂盒提取方法,研究了dna提取过程中琼脂糖凝胶浓度、样品加样量、洗脱液用量及乙醇浓度4个因素对直立白薇基因组DNA提取效果的影响,以期获得最适宜直立白薇基因组DNA的提取方法。结果表明:琼脂糖凝... 详细信息

以新鲜直立白薇叶片为试材,采用dna试剂盒提取方法,研究了dna提取过程中琼脂糖凝胶浓度、样品加样量、洗脱液用量及乙醇浓度4个因素对直立白薇基因组DNA提取效果的影响,以期获得最适宜直立白薇基因组DNA的提取方法。结果表明:琼脂糖凝胶浓度为0.8%,点样量为13μL,同时以80%乙醇沉淀,洗脱缓冲液用量为100μL时电泳条带最为清晰明亮、不拖尾,为直立白薇基因组DNA最优提取方法。综上,基于试剂盒方法进行提取优化,获得高纯度直立白薇dna,为直立白薇分子生物学及遗传学的研究奠定基础,为保证正品直立白薇药材资源开发和利用提供参考依据。

关键词：直立白薇试剂盒基因组DNA 条件优化分子生物

鲜榨果汁基因组DNA快速提取方法的建立及优化

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食品安全质量检测学报 2023年第20期14卷 17-25页

作者：王琳邢冉冉邓婷婷易秋菊王旭陈颖天津科技大学食品科学与工程学院天津300457 中国检验检疫科学研究院北京100176

目的建立及优化鲜榨果汁基因组DNA快速提取方法。方法本研究比较了植物dna快速提取试剂盒法、棉签法、纤维素膜片法和滤纸片法4种方法提取15种鲜榨果汁基因组DNA的效果,并筛选不同的提取液和裂解液、优化裂解液中的盐酸胍浓度和果汁基... 详细信息

目的建立及优化鲜榨果汁基因组DNA快速提取方法。方法本研究比较了植物dna快速提取试剂盒法、棉签法、纤维素膜片法和滤纸片法4种方法提取15种鲜榨果汁基因组DNA的效果,并筛选不同的提取液和裂解液、优化裂解液中的盐酸胍浓度和果汁基因组提取时间。结果滤纸片法采用dna裂解液(6 mol/L盐酸胍、1%聚乙烯吡咯烷酮、50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、20 mmol/L乙二胺四乙酸、21.3 mmol/L曲拉通-X-100;pH 6.4)、dna漂洗液3(8 mol/L盐酸胍、50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐;pH 6.4)和dna漂洗液4(10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、100 mmol/L氯化钠;pH 8.0)即可在5 min内从鲜榨果汁中提取得到适用于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的基因组DNA。结论本研究建立的滤纸片法不需要离心机等昂贵的仪器设备、操作简单、无刺激性气味、无环境条件限制,具有快速、价廉、环保等优点,为果汁基因组DNA快速提取与现场鉴定研究提供了参考。

关键词：鲜榨果汁滤纸片法基因组DNA 快速提取方法

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槟榔叶表微生物基因组DNA提取方法的比较

分子植物育种 2023年

作者：马瑞王贞霖芮凯徐芮白蓓蓓杨顺义甘肃农业大学植物保护学院甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室海南省农业科学院植物保护研究所海南省农业科学院农产品质量安全与标准研究中心海南省植物病虫害防控重点实验室农业农村部海口作物有害生物科学观测实验站海南省农业科学院三亚研究院

为确定槟榔叶表微生物基因组DNA的最佳提取方法，本研究采用改良CTAB法、MP Biomedicals土壤试剂盒、QIAGEN土壤试剂盒、天根多糖多酚植物试剂盒和MP Biomedicals植物试剂盒分别提取槟榔叶表微生物基因组DNA，通过超微量分光光度计测定... 详细信息

为确定槟榔叶表微生物基因组DNA的最佳提取方法，本研究采用改良CTAB法、MP Biomedicals土壤试剂盒、QIAGEN土壤试剂盒、天根多糖多酚植物试剂盒和MP Biomedicals植物试剂盒分别提取槟榔叶表微生物基因组DNA，通过超微量分光光度计测定、变性梯度凝胶电泳和聚合酶链式反应(PCR)对提取效果进行比较。结果表明，采用MP Biomedicals植物试剂盒提取的dna效果最好，dna浓度为81.57 μg/mL，A260/A280值为1.80，A260/A230值为2.06，PCR扩增产物亮度高、无杂带，且具有提取时间短、效率高、污染小等特点。本研究为槟榔叶表微生物基因组DNA的提取提供了参考，为后续进行分子生物学实验提供了科学依据。

关键词：槟榔叶表微生物基因组DNA 提取方法

0~#柴油对斑马鱼基因组DNA和环境dna遗传毒性的RAPD比较

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水生生物学报 2020年第4期44卷 764-773页

作者：张雪张海波苏荣国汪靖超佘定懿宋修涵沙珍霞青岛大学生命科学学院青岛266071 中国海洋大学化学化工学院青岛266100

研究利用随机扩增多态性dna(Random Amplified Polymorphic dna,RAPD)技术,以斑马鱼基因组DNA和其养殖水体中的环境dna(environmental dna,edna)为模板,检测0~#柴油可溶性组分对斑马鱼(Danio rerio)遗传毒性的影响。结果显示,通过基因组... 详细信息

研究利用随机扩增多态性dna(Random Amplified Polymorphic dna,RAPD)技术,以斑马鱼基因组DNA和其养殖水体中的环境dna(environmental dna,edna)为模板,检测0~#柴油可溶性组分对斑马鱼(Danio rerio)遗传毒性的影响。结果显示,通过基因组DNA和edna扩增的RAPD图谱均可检测到0~#柴油对斑马鱼的遗传毒性。在未受到柴油暴露时,斑马鱼基因组DNA和水环境中edna在96h内的RAPD图谱均无明显变化;在不同浓度的柴油暴露下,随着暴露时间(0、24h、48h、72h、96h)延长,基因组DNA和edna的多态性位点减少,模板稳定性降低;随着柴油浓度(15%、50%、100%)的增加,基因组DNA和edna的多态性位点也减少,模板稳定性降低。这表明0~#柴油对斑马鱼基因组DNA和edna的遗传毒性均呈现时间-效应和浓度-效应关系,并且无论以斑马鱼基因组DNA还是edna为模板,柴油暴露组和未进行暴露的对照组的RAPD扩增图谱条带变化趋势一致。研究结果为通过RAPD技术检测柴油对水生生物的遗传毒性提供了新的研究思路和技术手段。

关键词：柴油斑马鱼基因组DNA edna RAPD 遗传毒性

高效、快速提取高质量稻曲病菌基因组DNA方法

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东北农业大学学报 2020年第3期51卷 1-7页

作者：张俊华马玥杨明秀宋爽刘连夫杨硕东北农业大学农学院哈尔滨150030

稻曲病菌[Ustilaginoidea virens(Cooke)Takahashi]培养期间菌丝生长缓慢,且产生大量次生代谢产物,严重影响提取稻曲病菌基因组DNA质量与效率。将一步式提取法(Rapid one-step extraction,ROSE)增加异丙醇、NaAc冷冻沉淀dna和70%无水乙... 详细信息

稻曲病菌[Ustilaginoidea virens(Cooke)Takahashi]培养期间菌丝生长缓慢,且产生大量次生代谢产物,严重影响提取稻曲病菌基因组DNA质量与效率。将一步式提取法(Rapid one-step extraction,ROSE)增加异丙醇、NaAc冷冻沉淀dna和70%无水乙醇漂洗dna两个步骤,建立一种高效、快速提取高质量稻曲病菌基因组DNA的方法,即改良ROSE法,并将该方法与稻曲病菌基因组DNA传统提取方法(CTAB法、SDS法、试剂盒法和改良脲素法)在提取步骤、dna纯度与得率、PCR反应和酶切效率等方面加以比较。结果表明,5种方法均得到稻曲病菌基因组DNA,但改良ROSE法同时具有无毒、环保、低成本、快速获取高质量dna的优点。改良ROSE法s可用于稻曲病菌分子标记、遗传图谱构建等需短时间内快速获取dna的分子试验研究,也适用于稻曲病菌基因精细定位、克隆和测序等需高质量dna的分子试验。

关键词：稻曲病菌基因组DNA 改良ROSE法高效

Selection of a dna barcode for Nectriaceae from fungal whole-genomes

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Science China(Life Sciences) 2012年第1期55卷 80-88页

作者： ZENG ZhaoQing ZHAO Peng LUO Jing ZHUANG WenYing YU ZhiHe State Key Laboratory of Mycology Institute of MicrobiologyChinese Academy of SciencesBeijing 100101China Graduate University of Chinese Academy of Sciences Beijing 100049China College of Life Sciences Yangtze UniversityJingzhou 434025China

A dna barcode is a short segment of sequence that is able to distinguish species. A barcode must ideally contain enough variation to distinguish every individual species and be easily obtained. Fungi of Nectriaceae are economically important and show high species diversity. To establish a standard dna barcode for this group of fungi, the genomes of Neurospora crassa and 30 other filamentous fungi were compared. The expect value was treated as a criterion to recognize homologous sequences. Four candidate markers, Hsp90, AAC, CDC48, and EF3, were tested for their feasibility as barcodes in the identification of 34 well-established species belonging to 13 genera of Nectriaceae. Two hundred and fifteen sequences were analyzed. Intraand inter-specific variations and the success rate of PCR amplification and sequencing were considered as important criteria for estimation of the candidate markers. Ultimately, the partial EF3 gene met the requirements for a good dna barcode: No overlap was found between the intra-and inter-specific pairwise distances. The smallest inter-specific distance of EF3 gene was 3.19%, while the largest intra-specific distance was 1.79%. In addition, there was a high success rate in PCR and sequencing for this gene (96.3%). CDC48 showed sufficiently high sequence variation among species, but the PCR and sequencing success rate was 84% using a single pair of primers. Although the Hsp90 and AAC genes had higher PCR and sequencing success rates (96.3% and 97.5%, respectively), overlapping occurred between the intraand inter-specific variations, which could lead to misidentification. Therefore, we propose the EF3 gene as a possible dna barcode for the nectriaceous fungi.

关键词：基因组DNA 丝状真菌条码 PCR扩增物种多样性最小距离粗糙脉孢菌 HSP90

鲫鱼基因组DNA的扩增及在SSR分析中的验证

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云南农业大学学报（自然科学版） 2019年第6期34卷 988-993页

作者：武祥伟罗荣荣华王晓雯邓君明孔令富毕保良云南农业大学动物科学技术学院云南昆明650201 云南省临沧市镇康县水产技术推广站云南镇康677704 云南省高原渔业资源保护与可持续利用重点实验室云南昆明650201

【目的】优化鲫鱼全基因组DNA扩增方法。【方法】使用内切酶酶切初孵仔鱼的基因组DNA,酶切片段连接寡核苷酸接头,根据酶切位点序列与接头序列设计引物,采用PCR法扩增酶切片段,增加基因组DNA的数量。【结果】使用Taq I内切酶酶切鲫鱼基因... 详细信息

【目的】优化鲫鱼全基因组DNA扩增方法。【方法】使用内切酶酶切初孵仔鱼的基因组DNA,酶切片段连接寡核苷酸接头,根据酶切位点序列与接头序列设计引物,采用PCR法扩增酶切片段,增加基因组DNA的数量。【结果】使用Taq I内切酶酶切鲫鱼基因组DNA,酶切片段连接寡核苷酸接头后PCR扩增,获得扩增产物集中于250~1 500 bp。以扩增的滇池高背鲫鱼基因组DNA为模板,PCR扩增滇池高背鲫鱼的微卫星分子标记(SSR)位点,获得预期的扩增片段,电泳图谱与对照组(未扩增的基因组DNA为PCR模板)无差异。【结论】本研究优化了鲫鱼基因组DNA的扩增方法,并可用于SSR分析中,为鱼类大规模遗传分析提供了技术支撑。

关键词：滇池高背鲫基因组DNA PCR 微卫星内切酶