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增强乙醛酸循环对大肠杆菌合成L-苏氨酸的影响

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现代食品科技 2015年第10期31卷 109-114页

作者：周茜郑会明刘辉谢希贤徐庆阳张成林陈宁天津科技大学生物工程学院代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室天津300457

L-苏氨酸是人类必需氨基酸,在医药、食品、饲料领域有广泛的应用。在L-苏氨酸发酵生产过程中,乙醛酸循环起到部分回补途径的功能。本实验利用Red重组技术,以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株,构建了icl R基因缺失菌株THRD... 详细信息

L-苏氨酸是人类必需氨基酸,在医药、食品、饲料领域有广泛的应用。在L-苏氨酸发酵生产过程中,乙醛酸循环起到部分回补途径的功能。本实验利用Red重组技术,以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株,构建了icl R基因缺失菌株THRDΔicl R以及不同强度启动子替换ace BAK启动子的菌株THRD P1和THRD P2。通过实时荧光定量PCR检测表明,苹果酸合酶基因(ace B)的表达量分别是原菌的1.89倍、2.11倍以及2.96倍。摇瓶发酵结果显示,THRDΔicl R的L-苏氨酸产量及糖酸转化率分别为42.60±1.23 g/L和32.77 g/g,较原菌THRD(35.32±1.07 g/L和27.17 g/g)分别提高20.61%和20.70%。THRD P1 L-苏氨酸产量及糖酸转化率分别为36.50±1.42 g/L和28.08 g/g,较原菌THRD(35.32±1.07 g/L和27.17 g/g)分别提高3.34%和3.39%。而THRD P2 8 h后菌体生长停滞,L-苏氨酸产量及糖酸转化率分别为8.31±1.31 g/L和20.78 g/g,较原菌THRD(35.32±1.07 g/L和27.17 g/g)分别降低了76.47%和23.52%。综上所述,适当增强乙醛酸循环有利于L-苏氨酸的积累,而过强的乙醛酸循环影响菌体的正常代谢。

关键词：大肠杆菌 L-苏氨酸回补乙醛酸循环启动子替换

ilvBNC操纵子协同cimA基因过表达提高Corynebacterium glutamicum YILW L-异亮氨酸产量的研究

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现代食品科技 2016年第2期32卷 27-32,72页

作者：温冰徐国栋刘远徐庆阳谢希贤张成林陈宁代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室天津科技大学生物工程学院天津300457 天津市工业微生物研究所有限公司天津300462

L-异亮氨酸是人和动物八种必需氨基酸之一,在生命活动中具有重要地位。乙酰羟基酸合成酶(acetohydroxyacid synthase,AHAS)是L-异亮氨酸合成途径的关键酶(由ilvBN编码),α-酮基丁酸是L-异亮氨酸合成的重要前体。因此强化ilvBN的表达以... 详细信息

L-异亮氨酸是人和动物八种必需氨基酸之一,在生命活动中具有重要地位。乙酰羟基酸合成酶(acetohydroxyacid synthase,AHAS)是L-异亮氨酸合成途径的关键酶(由ilvBN编码),α-酮基丁酸是L-异亮氨酸合成的重要前体。因此强化ilvBN的表达以及增加α-酮基丁酸的供应理论上可提高L-异亮氨酸的合成。cim A编码的甲基苹果酸合成酶可以催化丙酮酸和乙酰-Co A快速生成L-异亮氨酸前体α-酮基丁酸,从而增强主代谢流通量。本文采用基因重组手段将L-异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum YILW ilvBNC操纵子中的启动子替换为强启动子Ptac获得*** YILWPtac。摇瓶发酵结果显示该菌株L-异亮氨酸产量和转化率分别较出发菌株提高了14.8%和18.6%。在此基础上过表达cimA基因,获得*** YILWPtacp XMJ19cim A,其L-异亮氨酸酸产量和糖酸转化率分别较出发菌株提高了14.5%和42.4%。本研究可为氨基酸生产菌株的选育提供依据。

关键词： L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌 α-酮基丁酸启动子替换柠苹酸合成酶

波卓霉素生物合成基因簇的异源表达及产量提高

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华中农业大学学报 2015年第1期34卷 49-58页

作者：周威张学文庄以彬刘晓楠殷华郁彭刘涛天津科技大学生物工程学院天津300457 中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308

波卓霉素是从波卓链霉菌(Streptomyces bottropensis)中分离得到的,具有抗革兰氏阳性菌及支原体的生物活性,尤其重要的是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和抗万古霉素肠球菌有抑菌活性。试验通过构建基因组文库,PCR筛选获得包含完整波卓霉... 详细信息

波卓霉素是从波卓链霉菌(Streptomyces bottropensis)中分离得到的,具有抗革兰氏阳性菌及支原体的生物活性,尤其重要的是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和抗万古霉素肠球菌有抑菌活性。试验通过构建基因组文库,PCR筛选获得包含完整波卓霉素合成基因簇的柯斯质粒4E11,通过接合转移的方法把4E11转化至天蓝色链霉菌M145中,对获得的异源表达株M145/4E11进行发酵,通过提取纯化和HPLC-MS检测,表明M145/4E11发酵液中产生了波卓霉素;试验并通过Red/ET重组系统,以红霉素启动子(ermE*P1)替换了波卓霉素生物合成簇抗性基因btmA和前提肽合成基因btmD的启动子,成功实现异源表达株M145/4E11波卓霉素的产量提高。

关键词：波卓链霉菌波卓霉素基因组文库异源表达启动子替换

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刺糖多孢菌菌株遗传改良的研究

刺糖多孢菌菌株遗传改良的研究

作者：易卓湖南师范大学

学位级别：硕士

新型的微生物源杀虫剂多杀菌素是由放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵后产生的一种胞内次级代谢产物。因其对农业害虫有着极好的杀虫效果,而对哺乳动物、鱼类、鸟类和大多数益虫具有极高的安全界限,兼具化学农药... 详细信息

新型的微生物源杀虫剂多杀菌素是由放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵后产生的一种胞内次级代谢产物。因其对农业害虫有着极好的杀虫效果,而对哺乳动物、鱼类、鸟类和大多数益虫具有极高的安全界限,兼具化学农药的高效性与生物农药的安全性,正成为最具发展前景的新一代杀虫剂。但其产量低下,且发酵周期长达二至三周,使得生产成本极高,严重制约了其生产及实际应用。因此,进行菌种改良,以尽可能地提高多杀菌素产量,成为了开发该种杀虫剂最迫切需要解决的问题之一。传统的理化诱变和筛选虽然有效,但有工作量大并且不能定向等缺陷。本研究尝试从原生质体融合和启动子替换两方来提高多杀菌素产量。本研究中利用PCR分别从红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea) NRRL2338扩增了其eryAl基因内部1.1kb的同源片段,从刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa) SP06081中扩增了7.8kb的spnA基因和2.7kb的tspnA基因片段(spnA基因起始模块的一部分)。将该eryAI基因内部的同源片段经双酶切之后与载体pOJ260相连接,构建了阻断红色糖多孢菌产红霉素的载体pOJ260D。将载体pOJ260D转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002),然后与红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea) NRRL2338接合转移。培养若干天后,挑取转化子在含有适宜浓度阿伯拉霉素(Apramycin)的BHI平板转接培养2次,得到了一株不产红霉素的红色糖多孢菌——红色糖多孢菌D。经过根据阿伯拉霉素抗性基因设计的引物的PCR分析,红色糖多孢菌D的分子核酸特征得到了验证。将红色糖多孢菌D进行固体平板培养,进行形态观察,发现其产色素的量较原始菌株红色糖多孢菌NRRL2338多;将红色糖多孢菌D进行摇瓶发酵培养,HPLC检测其已经不产红霉素。将红色糖多孢菌D和刺糖多孢菌SP06081分别培养制备原生质体,然后融合。随机挑取再生平板上80个菌落经加有适宜浓度阿伯拉霉素的固体平板转接培养两次后,分别摇瓶发酵培养,HPLC检测菌株产多杀菌素情况,得到4株产多杀菌素的融合菌株。取融合菌发酵液HPLC收集峰液做质谱分析,进一步证实融合菌株产生多杀菌素。基于4株融合菌株多杀菌素产量都不及起始菌株高,我们接着采用不加抗生素直接筛选的方法,成功筛选到若干高产多杀菌素的融合菌株,其中菌株B-2多杀菌素产量提高最为明显,较原始菌株增加了331%。后续传代培养表明融合菌株B-2多杀菌素产量稳定,遗传稳定性较好。将tspnA PCR产物双酶切之后然后与载体pLSB2连接,构建了刺糖多孢菌启动子替换载体pLSB2-tspnA,并成功转入具有接合转移功能的大肠杆菌S17-1中,得到了工程菌株S17-1(pLSB2-tspnA),准备结合转移操作。本文对红色糖多孢菌和刺糖多孢菌原生质体融合进行了研究并且成功提高了多杀菌素的产量,这为具有优良发酵特性的红色糖多孢菌和刺糖多孢菌融合菌株的构建提供了重要基础;act Ⅱ-ORF4/Pact Ⅰ激活-启动元件替换刺糖多孢菌中多杀菌素生物合成基因簇的启动子,同时增加spnA基因的拷贝数,也将带来关于多杀菌素产量提高方面的新的启示。

关键词：多杀菌素原生质体融合启动子替换红霉素阻断质谱分析

高产iturin A解淀粉芽胞杆菌工程菌的构建及其发酵工艺优化

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高产iturin A解淀粉芽胞杆菌工程菌的构建及其发酵工艺优化

作者：张红华中农业大学

学位级别：硕士

伊枯草菌素A是主要由枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌合成产生的一种脂肽,因其表现出很强的抗菌活性与溶血活性,对环境友好,所以在植物病害的生物防治等诸多领域有着非常重要的价值。现阶段发酵产量低下并且其液体深层发酵生产工艺难于控... 详细信息

伊枯草菌素A是主要由枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌合成产生的一种脂肽,因其表现出很强的抗菌活性与溶血活性,对环境友好,所以在植物病害的生物防治等诸多领域有着非常重要的价值。现阶段发酵产量低下并且其液体深层发酵生产工艺难于控制严重阻碍了伊枯草菌素等抗菌脂肽的大规模工业化生产及其应用。本研究以解淀粉芽胞杆菌HZ-12为研究对象,通过同源重组的方法,将来源于地衣芽胞杆菌DW2的杆菌肽生物合成操纵子启动子P、枯草芽胞杆菌168启动子P43以及surfactin合成启动子P分别替换解淀粉芽胞杆菌HZ-12基因组中控制iturin A生物表达的启动子P,从而得到解淀粉芽胞杆菌HZ12-Pbac Aitu、HZ12-P43itu及HZ12-Psrfitu系列iturin A工程菌株。在基础出发发酵培养基及条件下,对比iturin A工程菌和原始菌HZ-12的iturin A合成量,结果表明在初始相同发酵条件下解淀粉芽胞杆菌HZ12-Pbac Aitu和HZ12-P43itu的iturin A产量依次达950.08mg/L和735.12 mg/L,与出发菌株HZ-12比较而言分别提高了1.32倍和0.80倍的。而HZ-12-Psrfitu的iturin A产量51.15 mg/L,明显低于原始菌HZ-12。进一步利用q RT-PCR对重组工程菌与原始菌iturin A合成酶Itu D的编码基因itu D的转录水平进行检测,所得到的实验结果证实系列重组菌株itu D的转录量的变化趋势与各菌株的iturin A合成能力是一致的,这也说明在不同启动强度的启动子控制之下iturin A的生物合成操纵子itu可以发生差异性表达,从而使得iturin A的合成量出现差异。本研究以构建的iturin A高产工程菌HZ12-Pbac Aitu研究对象,利用单因素实验与正交设计相结合的方法优化iturin A摇瓶发酵培养基的成分与发酵条件。结果得到iturin A合成的最适碳源是玉米淀粉,有机氮源更加适合iturin A的合成且豆粕是其最适氮源,无机盐KHPO与Fe SO·7HO的浓度也显著影响iturin A的产量,而Mg SO·7HO与Mn SO·HO对iturin A合成影响不显著。最终优化得到的培养基组成成分为:50 g/L玉米淀粉,70 g/L豆粕,1 g/L KHPO,0.50 g/L Mg SO·7HO,0.20 g/L Fe SO·7HO,0.02 g/L Mn SO·HO;进一步优化发酵条件得出:当培养温度为28°C、种子液种龄9 h、发酵接种量为(v/v)2%、发酵初始p H 6.0时,HZ12-Pbac Aitu的iturin A产量可达到1976.24 mg/L,与出发培养基相比较提高了1.08倍,同时较原始菌HZ-12提高了3.83倍。为解决抗菌脂肽液体深层发酵过程中普遍存在的剧烈产泡问题,本研究尝试对解淀粉芽胞杆菌HZ12-Pbac Aitu合成iturin A时的发酵副产物强表面活性surfactin合成基因srf AC进行敲除得到其缺失菌株HZ12-Pbac Aitu-Δsrf AC;相同条件下,HZ12-Pbac Aitu-△srf AC在5L发酵罐中进行iturin A发酵过程中,srf AC缺失菌株HZ12-Pbac Aitu-△srf AC消泡剂使用量较HZ12-Pbac Aitu减少20%,其产泡现象也有一定程度的减轻。解淀粉芽胞杆菌HZ12-Pbac Aitu-△srf AC在5L发酵罐中iturin A产量达到1400mg/L左右,满足商业化生产要求,并且为接下来放大生产奠定了较好基础。

关键词：伊枯草菌素A 解淀粉芽胞杆菌启动子替换发酵工艺优化

枯草芽孢杆菌利用阿拉伯糖合成丰原素的理性代谢优化

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枯草芽孢杆菌利用阿拉伯糖合成丰原素的理性代谢优化

作者：靳佳琦天津大学

学位级别：硕士

丰原素是芽孢杆菌产生的具有抗真菌、抗肿瘤及抗生物黏附等多种活性的两亲性环脂肽。本文主要通过氮源优化与理性代谢改造等策略,构建了能够利用阿拉伯糖高效生产丰原素的枯草芽孢杆菌优势工程菌株。为筛选阿拉伯糖作为发酵碳源时最适... 详细信息

丰原素是芽孢杆菌产生的具有抗真菌、抗肿瘤及抗生物黏附等多种活性的两亲性环脂肽。本文主要通过氮源优化与理性代谢改造等策略,构建了能够利用阿拉伯糖高效生产丰原素的枯草芽孢杆菌优势工程菌株。为筛选阿拉伯糖作为发酵碳源时最适合生产丰原素的氮源,以实验室保藏的引入4’-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因sfp和多效调控因子基因deg Q的BSJ00作为初始菌株,探究了氮源对丰原素产量的影响。实验结果表明水溶性黄豆饼粉是最适合生产丰原素的氮源,所产生的丰原素是质荷比(m/z)为1463.8、1464.8、1477.8、1489.8、1491.8、1505.8、1506.8左右的混合物,最高丰原素的产量达到了121.20 mg/L。对丰原素生物合成基因簇的启动子进行替换改善了丰原素的生物合成。采用CRISPR-Cas9技术分别以P、P及P启动子替换BSJ00丰原素生物合成基因簇原有的启动子。结果表明P和P的替换均不利于丰原素的合成,而以P启动子替换的菌株BSJ02的丰原素产量比BSJ00增加了13.07%,达到137.05mg/L。进一步的相对荧光强度分析揭示了P启动子在枯草芽孢杆菌中时期依赖性的表达特点。脂肪酸作为丰原素合成的重要前体之一,通过脂肪酸通路的理性优化改善了丰原素的合成。在确定脂肪酸通路的单一改造对丰原素的合成具有正向作用后,探究了脂肪酸通路的组合改造对丰原素产量的影响。即以BSJ02作为出发菌株,通过敲除3-羟基酰基Co A脱水酶基因fad B、以P启动子过表达脂肪酸酰基Co A连接酶基因yhf L来强化脂酰Co A的供应,同时导入以P启动子过表达生物素羧化酶Ⅱ基因yng H、外源硫酯酶基因tes A的游离质粒表达盒来增强脂肪酸的合成。所构建的菌株BSJ023的最高丰原素产量达到了258.41 mg/L,丰原素的最终得率为0.013 g/g阿拉伯糖,是BSJ00的2倍。最后,qRT-PCR的结果表明BSJ023中编码丰原素生物合成基因簇与关键调控因子的相关基因相比于BSJ00显著上调了2.58～14.77倍。对立枯丝核菌和灰葡萄孢霉菌的抗真菌活性的分析揭示了BSJ023产生的丰原素具有稳定的理化性质和显著的抗真菌活性。

关键词：枯草芽孢杆菌168 丰原素启动子替换脂肪酸通路改造抗真菌活性

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稻瘟病菌中一个新的效应因子家族的功能初探

稻瘟病菌中一个新的效应因子家族的功能初探

作者：吴晓贤福建农林大学

学位级别：硕士

水稻是人类的主要粮食作物之一。由丝状子囊真菌稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是造成水稻产量的急剧下降的重要病害之一。因为其经济重要性和遗传转化易操作性,稻瘟病菌已经成为研究宿主-病原真菌相互作用的模式生物。效应... 详细信息

水稻是人类的主要粮食作物之一。由丝状子囊真菌稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是造成水稻产量的急剧下降的重要病害之一。因为其经济重要性和遗传转化易操作性,稻瘟病菌已经成为研究宿主-病原真菌相互作用的模式生物。效应因子在稻瘟病菌与水稻的互作过程中起重要作用,能够调节宿主植物的免疫系统和生理状态以促进侵染,因此,对效应因子功能及其作用机理的深入研究,有助于进一步阐明稻瘟病菌的致病机制,也将为更持久有效地防控稻瘟病提供坚实的理论依据。我们在稻瘟病菌中发现了一个可能在与宿主互作过程中起重要作用的新基因家族(Host adaptation gene,Hag)。在以水稻为寄主的稻瘟菌株中共鉴定出21个基因家族成员,初步的侵染阶段亚细胞定位研究表明,MoHag1定位于活体营养界面复合物(Biotrophic interfacial complex,BIC)上,其他成员侵染阶段的亚细胞定位尚未明确。因此,我们通过同源重组的方法用MoHag1的启动子(1kb)来替代其他基因家族成员的自身启动子,进而分析其他基因家族成员的亚细胞定位。实验结果显示基因Mollag1在同源重组转化子中没有可见的荧光信号,但在异位整合的转化子中MoHag1可在附着胞胞孔处形成环状结构,说明不同长度的启动子片段会影响蛋白的表达水平和定位模式,因此,MoHag1的启动子并不适用于其他家族成员的亚细胞定位分析。此外,本研究还通过农杆菌介导的瞬时表达系统,分析了四个该基因家族成员是否能诱导细胞程序性死亡(PCD)或抑制Bax诱导产生的 PCD。我们分别构建了MoHag1、MoHag3、MoHag4 和MoHag8 的全长编码序列(FL)和去信号肽序列(NS)的烟草瞬时表达载体,通过烟草注射实验我们发现,MoHag1L、MoHag1S、MoHag3L和MoHag3S都可抑制BAX诱导的PCD,而MoHag4L、MoHag4S、MoHag8L 和 MoHag8S 既不能抑制 BAX 诱导的PCD也不能直接诱导细胞凋亡。由此可见,该基因家族的部分成员可以抑制BAX诱导的PCD,可能作为效应因子参与稻瘟病菌的侵染致病过程。

关键词：稻瘟病菌效应因子启动子替换瞬时表达

产十二碳二元酸Candida tropicalis工程菌的构建及油脂的高效转化研究

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产十二碳二元酸Candida tropicalis工程菌的构建及油脂的高效转化...

作者：彭健齐鲁工业大学

学位级别：硕士

长链二元酸(Long chain dicarboxylic acid)是一类用途极其广泛的脂肪族二羧酸。热带假丝酵母(Candida tropicalis)是可以通过发酵脂肪酸和烷烃来生产长链二元酸(DCA)的高产微生物。本研究以能够催化油脂生产长链二元酸的*** 1798为研... 详细信息

长链二元酸(Long chain dicarboxylic acid)是一类用途极其广泛的脂肪族二羧酸。热带假丝酵母(Candida tropicalis)是可以通过发酵脂肪酸和烷烃来生产长链二元酸(DCA)的高产微生物。本研究以能够催化油脂生产长链二元酸的*** 1798为研究对象,利用大肠杆菌中的mazF基因作为反向筛选标记构建了自杀载体pPICPJm,以促进热带假丝酵母甘油利用的基因gk、调控脂肪酸β-氧化过程的基因CRAT以及ω-氧化过程中的关键酶P450为目标,在通过分子生物学技术构建的基因无痕编辑系统基础上对gk基因和细胞色素P450酶、NADH-细胞色素P450还原酶的启动子基因进行替换,对肉毒碱乙酰转移酶基因CRAT作单拷贝敲除。论文的主要结果如下:(1)获取来源于大肠杆菌Escherichia coli中的毒素蛋白基因mazF基因,解脂耶氏酵母Candida lipolytica 1457中的启动子基因pGAL,通过重叠PCR方法构建重叠片段pGAL-mazF,将其连同抗性标签Kan基因通过无缝克隆手段连接至载体pPICzαA构建成自杀质粒pPICPJm作为热带假丝酵母分子改造过程中的基因无痕编辑载体。将自杀质粒pPICPJm电转化至***并通过抗生素G418抗性及PCR筛选后,分别在含有半乳糖浓度为0 g/L,5 g/L和10 g/L的平板上划线培养,结果显示10 g/L的半乳糖能够有效抑制***-pPICPJm的生长,因此后续以10 g/L的半乳糖筛选发生第二次单交换的重组子。(2)在自杀质粒pPICPJm的基础上,将*** 1798作为出发菌株,通过基因重组的手段,构建了工程菌*** gkPr,通过抗生素G418抗性及PCR筛选,证实gk基因启动子替换工程菌*** gkPr构建成功。经发酵验证显示,启动子基因替换菌*** gkPr甘油利用率提升了56.1%,表明启动子替换能促进*** 1798对甘油吸收利用,从而为热带假丝酵母发酵供能。以玉米油为底物进行发酵时还发现重组菌产十二碳二元酸的量比出发菌提高32.7%。(3)利用PCR技术扩增得到***的同源臂CRATpF和CRATpR,重叠PCR拼接后,通过无缝克隆技术连接至自杀质粒pPICPJm,在*** gkPr基础上运用电转化法进行同源片段重组,构建了CRAT基因单拷贝缺失菌*** gkPc。通过抗生素G418抗性和PCR实验的筛选,证实了CRAT基因单拷贝缺失菌*** gkPc构建成功。摇瓶实验表明,单拷贝缺失菌*** gkPc十二碳二元酸产量较原始菌株*** 1798十二碳二元酸产量升高,产量为7.13 g/L。表明由于CRAT基因的单拷贝敲除,减弱了细胞内脂肪酸的消耗,导致产酸水平的提升。(4)基于以上的研究,以细胞色素P450酶和NADPH-细胞色素P450还原酶为目标,在*** gkPc的基础上,对细胞色素P450和NADPH-细胞色素P450还原酶的启动子基因进行了替换,构建了启动子替换工程菌*** GCPP。摇瓶发酵显示重组菌株*** GCPP十二碳二元酸产量为11.39 g/L,是原始菌产量的2.8倍,5 L发酵罐发酵显示*** GCPP十二碳二元酸产量达到了35.64 g/L。

关键词：热带假丝酵母十二碳二元酸基因无痕编辑自杀质粒启动子替换

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酿酒酵母合成麦角固醇代谢工程研究

酿酒酵母合成麦角固醇代谢工程研究

作者：卫云萍华中科技大学

学位级别：硕士

麦角固醇是真菌细胞膜的重要组成部分,是维生素D等甾体类药物的重要前体,市场需求大且供不应求。目前,麦角固醇主要从酵母、青霉菌中提取,存在含量低、生产成本高、生产能力不足等问题。许多研究者通过超表达麦角固醇合成路径中1～2个... 详细信息

麦角固醇是真菌细胞膜的重要组成部分,是维生素D等甾体类药物的重要前体,市场需求大且供不应求。目前,麦角固醇主要从酵母、青霉菌中提取,存在含量低、生产成本高、生产能力不足等问题。许多研究者通过超表达麦角固醇合成路径中1～2个基因或者理化诱变等方法改造酿酒酵母,缺乏对整个合成通路的系统研究。酿酒酵母合成麦角固醇的代谢工程改造,有望大幅提高麦角固醇产量。本文围绕酿酒酵母中麦角固醇合成与转运路径,系统分析筛选促进麦角固醇合成的候选关键酶,通过启动子替换、脂滴改造等方法实施模块化代谢工程改造,并结合培养条件优化,促进酿酒酵母中麦角固醇的合成,为利用酿酒酵母生产麦角固醇提供菌种代谢工程改造策略。取得的主要研究结果如下:(1)酿酒酵母中麦角固醇合成与转运路径候选关键酶筛选及其编码基因克隆。在系统分析酿酒酵母中麦角固醇合成及转运路径候选关键酶的基础上,利用分子对接技术对麦角固醇合成关键步骤酶:HMG-CoA还原酶、角鲨烯合成酶、角鲨烯环氧酶、甾醇还原酶进行虚拟筛选。结果表明,在Uni Prot数据库随机选择的不同生物来源的各16～20种酶中,来源于酿酒酵母的HMG-Co A还原酶(HMG1)、角鲨烯合成酶(ERG9)、角鲨烯环氧酶(ERG1)、甾醇还原酶(ERG4)与相应底物有较强亲和力。对候选关键酶的理化性质、跨膜结构域、与底物结合力等特征进行分析发现:酿酒酵母来源的ERG9、ERG4、ERG1可直接用于代谢工程改造,HMG1需要通过截短ERAD靶向结构域来消除产物反馈调节作用并提高酶活。(2)对麦角固醇转运存储模块和以ERG9为枢纽的麦角固醇合成路径上、下游模块进行代谢工程改造,促进酿酒酵母合成麦角固醇。首先,通过P替换ARE2启动子以及敲除FLD1基因,优化麦角固醇转运存储模块,使过量合成的麦角固醇能大量转运并存储于脂滴;进一步通过P替换ERG1和ERG4的启动子,优化麦角固醇合成路径下游模块,加强下游代谢通量,避免中间产物积累,麦角固醇含量提高69.9%,产量提高66.6%,酵母生物量无显著性差异;最后,通过将P-t HMG1-T整合至YPRCdelta15位点,优化麦角固醇合成路径上游模块,突破限速步骤,加强上游代谢通量,丰富前体供应,促进了酵母生长并增加生物量69.6%,麦角固醇含量增加66.9%,最终产量增加183.9%。(3)基于培养条件优化的酵母工程菌WYP9发酵性能评价。单因素实验结果表明,蔗糖、麦芽糖是合适的碳源,酵母提取物是合适的氮源,培养基初始p H影响酵母工程菌WYP9发酵性能。正交试验获得优化的培养条件:42.75 g/L蔗糖,45.00 g/L麦芽糖,10.00 g/L酵母提取物,培养基初始pH=5.80。与改造前酿酒酵母相比,酵母工程菌WYP9生物量提高212.1%,麦角固醇含量提高83.8%,最终产量提高473.5%。综上所述,本研究提出了利用酿酒酵母发酵生产麦角固醇的代谢工程策略,即通过P替换ARE2启动子、敲除FLD1基因、P替换ERG1和ERG4启动子、P-t HMG1-T整合至YPRCdelta15位点,改造酿酒酵母合成与转运麦角固醇路径等,使麦角固醇产量大幅提升。

关键词：麦角固醇代谢工程关键酶筛选启动子替换脂滴改造