刺糖多孢菌菌株遗传改良的研究

作     者：易卓 

作者单位：湖南师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：夏立秋

授予年度：2012年

学科分类：090403[农学-农药学(可授农学、理学学位）] 09[农学] 0904[农学-植物保护] 

主      题：多杀菌素 原生质体融合 启动子替换 红霉素阻断 质谱分析 

摘      要：新型的微生物源杀虫剂多杀菌素是由放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵后产生的一种胞内次级代谢产物。因其对农业害虫有着极好的杀虫效果,而对哺乳动物、鱼类、鸟类和大多数益虫具有极高的安全界限,兼具化学农药的高效性与生物农药的安全性,正成为最具发展前景的新一代杀虫剂。但其产量低下,且发酵周期长达二至三周,使得生产成本极高,严重制约了其生产及实际应用。因此,进行菌种改良,以尽可能地提高多杀菌素产量,成为了开发该种杀虫剂最迫切需要解决的问题之一。传统的理化诱变和筛选虽然有效,但有工作量大并且不能定向等缺陷。本研究尝试从原生质体融合和启动子替换两方来提高多杀菌素产量。 本研究中利用PCR分别从红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea) NRRL2338扩增了其eryAl基因内部1.1kb的同源片段,从刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa) SP06081中扩增了7.8kb的spnA基因和2.7kb的tspnA基因片段(spnA基因起始模块的一部分)。 将该eryAI基因内部的同源片段经双酶切之后与载体pOJ260相连接,构建了阻断红色糖多孢菌产红霉素的载体pOJ260D。将载体pOJ260D转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002),然后与红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea) NRRL2338接合转移。培养若干天后,挑取转化子在含有适宜浓度阿伯拉霉素(Apramycin)的BHI平板转接培养2次,得到了一株不产红霉素的红色糖多孢菌——红色糖多孢菌D。经过根据阿伯拉霉素抗性基因设计的引物的PCR分析,红色糖多孢菌D的分子核酸特征得到了验证。将红色糖多孢菌D进行固体平板培养,进行形态观察,发现其产色素的量较原始菌株红色糖多孢菌NRRL2338多;将红色糖多孢菌D进行摇瓶发酵培养,HPLC检测其已经不产红霉素。 将红色糖多孢菌D和刺糖多孢菌SP06081分别培养制备原生质体,然后融合。随机挑取再生平板上80个菌落经加有适宜浓度阿伯拉霉素的固体平板转接培养两次后,分别摇瓶发酵培养,HPLC检测菌株产多杀菌素情况,得到4株产多杀菌素的融合菌株。取融合菌发酵液HPLC收集峰液做质谱分析,进一步证实融合菌株产生多杀菌素。 基于4株融合菌株多杀菌素产量都不及起始菌株高,我们接着采用不加抗生素直接筛选的方法,成功筛选到若干高产多杀菌素的融合菌株,其中菌株B-2多杀菌素产量提高最为明显,较原始菌株增加了331%。后续传代培养表明融合菌株B-2多杀菌素产量稳定,遗传稳定性较好。 将tspnA PCR产物双酶切之后然后与载体pLSB2连接,构建了刺糖多孢菌启动子替换载体pLSB2-tspnA,并成功转入具有接合转移功能的大肠杆菌S17-1中,得到了工程菌株S17-1(pLSB2-tspnA),准备结合转移操作。 本文对红色糖多孢菌和刺糖多孢菌原生质体融合进行了研究并且成功提高了多杀菌素的产量,这为具有优良发酵特性的红色糖多孢菌和刺糖多孢菌融合菌株的构建提供了重要基础;act Ⅱ-ORF4/Pact Ⅰ激活-启动元件替换刺糖多孢菌中多杀菌素生物合成基因簇的启动子,同时增加spnA基因的拷贝数,也将带来关于多杀菌素产量提高方面的新的启示。