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建立一种适用于毕赤酵母的新型反向筛选标记

建立一种适用于毕赤酵母的新型反向筛选标记

作者：牛硕湖北大学

学位级别：硕士

毕赤酵母的诸多优点决定了其在研究和生产领域具有非常大的研究潜力和商业价值。然而,毕赤酵母中能够被应用于基因工程操作的标记基因数量有限。Sleeping beauty（SB）转座子突变技术是利用SB转座子随机插入引起基因突变的特性而应用于... 详细信息

毕赤酵母的诸多优点决定了其在研究和生产领域具有非常大的研究潜力和商业价值。然而,毕赤酵母中能够被应用于基因工程操作的标记基因数量有限。Sleeping beauty（SB）转座子突变技术是利用SB转座子随机插入引起基因突变的特性而应用于分离及筛选未知基因的突变手段,可以用于挖掘新的标记基因。本研究利用SB转座子突变系统成功构建了一个涵盖毕赤酵母GS115全基因组的突变体库,成功筛选到一个雷帕霉素敏感基因,并利用该基因开发了一种适用于毕赤酵母的反向筛选技术。本研究使用10 ng/m L的雷帕霉素从毕赤酵母突变体库中分离出一株具有雷帕霉素抗性的突变株mut375。以该突变体的基因组DNA为模板,通过热不对称交错PCR（TAILPCR）获取SB转座子侧翼序列,对SB转座子的插入位点进行定位,确定了mut375的突变基因为PAS＿Chr2-2＿0375（命名为kFPR1）。本研究利用同源重组技术敲除kFPR1基因,发现毕赤酵母产生了雷帕霉素抗性,而且回补该基因功能后的菌株恢复了对雷帕霉素的敏感性,证明了kFPR1基因与雷帕霉素抗性之间的相关性。基于kFPR1基因的特性,本研究建立了一种适用于毕赤酵母的无标记基因操作方法。以博来霉素抗性基因（ZeoR）作为选择标记,kFPR1作为反向选择标记,构建了两侧携带正向重复序列的标记单元Zeo R-kFPR1。将标记单元通过同源重组整合至毕赤酵母基因组中,引入遗传标记Zeo R。在雷帕霉素培养基上进行反向筛选,通过标记单元两侧的正向重复序列之间的同源重组成功回收了选择标记,证明了kFPR1作为毕赤酵母反向筛选标记的可行性。本研究使用该方法在毕赤酵母中分别敲入了EGFP表达盒和敲除了LYS1基因,以上操作均没有引入非必要的选择标记。本研究建立了一种适用于毕赤酵母的反向筛选标记kFPR1,实现了无选择标记的基因敲除和敲入,为毕赤酵母的无标记基因操作提供了新工具。

关键词：毕赤酵母转座子突变雷帕霉素反向筛选标记 kFPR1

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毕赤酵母新型反向筛选标记基因的鉴定

湖北大学学报（自然科学版） 2022年第1期44卷 24-30页

作者：牛硕朱梅君魏子贡湖北大学生命科学学院湖北武汉430062

利用转座子突变技术构建毕赤酵母菌株突变库,并分离出能够在含雷帕霉素(10 ng/mL)培养基中生长的突变株mut375.通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)获取转座子侧翼序列,对转座子的插入位点进行定位.转座子插入PAS_Chr2-2_0375基因,破坏了其... 详细信息

利用转座子突变技术构建毕赤酵母菌株突变库,并分离出能够在含雷帕霉素(10 ng/mL)培养基中生长的突变株mut375.通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)获取转座子侧翼序列,对转座子的插入位点进行定位.转座子插入PAS_Chr2-2_0375基因,破坏了其开放阅读框的完整性,将该基因命名为kFPR1.本研究利用同源重组敲除kFPR1基因使毕赤酵母产生了雷帕霉素抗性,回补该基因功能的菌株则不能在含雷帕霉素的培养基上生长.基于kFPR1基因的特性,建立了一种适用于毕赤酵母的无标记基因操作方法.以kFPR1作为反向筛选标记成功构建了表达EGFP的重组菌株并且回收了ZeoR筛选标记,为毕赤酵母的遗传操作提供了新的筛选工具.

关键词：毕赤酵母反向筛选标记转座子突变技术雷帕霉素

毒素蛋白基因mazF在基因修饰系统中的应用进展

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生物技术通报 2014年第11期30卷 48-54页

作者：石杨董会娜张大伟天津大学药物科学与技术学院天津300072 中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308

毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxin system,TA系统)存在于大部分细菌中。mazEF是大肠杆菌中一种毒素-抗毒素系统。毒素基因mazF编码的MazF毒素蛋白可以特异性地剪切自由mRNA的ACA序列,从而抑制蛋白合成、引起细胞生长停滞;近些年,许多学... 详细信息

毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxin system,TA系统)存在于大部分细菌中。mazEF是大肠杆菌中一种毒素-抗毒素系统。毒素基因mazF编码的MazF毒素蛋白可以特异性地剪切自由mRNA的ACA序列,从而抑制蛋白合成、引起细胞生长停滞;近些年,许多学者利用mazF基因作为反向筛选标记对不同种微生物建立了无标记或无痕的基因修饰系统,并实现了不同菌株的基因组修饰。主要综述了大肠杆菌mazF基因作为反向筛选基因的应用原理及其在不同种类微生物的基因修饰系统中的应用进展,然后对mazF基因及其他毒素基因在基因修饰系统中的应用进行了展望。

关键词：毒素蛋白基因反向筛选标记基因修饰方法

利用sacB基因反向筛选法构建GFP分别融合于猪链球菌MapZ及PBP1b蛋白的融合菌株

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中国预防兽医学报 2022年第11期44卷 1149-1155页

作者：卫东陈平高广娟朱金鲁武柳君刘思国张跃灵中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为在猪链球菌(***)中引入高效的反向筛选标记,本研究根据***密码子偏好性优化了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)蔗糖果聚糖酶基因sacB的密码子,并由公司合成后作为模板,采用PCR扩增sacB基因片段;采用PCR从相应模板中分别扩增***中的启... 详细信息

为在猪链球菌(***)中引入高效的反向筛选标记,本研究根据***密码子偏好性优化了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)蔗糖果聚糖酶基因sacB的密码子,并由公司合成后作为模板,采用PCR扩增sacB基因片段;采用PCR从相应模板中分别扩增***中的启动子序列(Peno)及含壮观霉素抗性基因(spc)的片段;再经重叠延伸PCR扩增融合基因片段Peno-sacB-spc(PSS)。以相应模板及引物分别经PCR扩增*** mapZ基因待融合位点上下游序列UP1和DN1及其pbp1b基因待融合位点上下游序列UP2和DN2、含正/反向筛选标记的片段PSS1和PSS2基因片段,以及用于替换PSS片段的绿色荧光蛋白(GFP)gfp1和gfp2基因片段;再分别通过重叠延伸PCR扩增构建中间菌株的融合片段UP1-PSS1-DN1、UP2-PSS2-DN2以及构建GFP融合菌株的融合片段UP1-GFP1-DN1、UP2-GFP2-DN2。采用同源重组的方法将UP1-PSS1-DN1和UP2-PSS2-DN2分别转化*** 05ZYH33菌株,经壮观霉素筛选引入PSS的中间菌株。PCR及测序鉴定结果表明获得了引入PSS片段的中间菌株PSS-mapZ和PSS-pbp1b。将WT、PSS-mapZ和PSS-pbp1b分别培养于含不同浓度蔗糖(10%、7.5%、5%和2.5%)的TSAS平板上,确定WT生长而PSS-mapZ和PSS-pbp1b中间菌株不生长的蔗糖浓度(用于筛选及构建GFP融合菌株)。通过比较分析最终确定反向筛选GFP融合菌株的最适蔗糖浓度约为7%。通过同源重组的方法分别将UP1-GFP1-DN1片段转化PSS-mapZ菌株、UP2-GFP2-DN2片段转化PSS-pbp1b菌株,分别经含7%蔗糖(生长)及含壮观霉素(不生长)的TSAS平板筛选。随机选择经筛选获得的100个单菌落计算筛选的阳性率。各取6个单菌落经PCR及测序鉴定。结果显示,筛选菌株的阳性率在52%~75%。PCR及测序结果显示,获得的两种重组菌株中的gfp基因片段确实分别替换了PSS-mapZ和PSS-pbp1b中的相应PSS,表明正确构建了融合GFP的重组菌株GFP-mapZ和GFPpbp1b。本研究首次构建了高效的正/反向筛选标记PSS,以及无痕的*** GFP-mapZ和GFP-pbp1b融合菌株,为快速无痕的***遗传操作及深入研究***相关分子机制奠定了基础。

关键词：猪链球菌无痕突变 sacB基因反向筛选标记

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基于基因组重排技术选育D-核糖高产菌株

中国酿造 2019年第2期38卷 159-163页

作者：赵晨赵祥颖张家祥张立鹤刘建军齐鲁工业大学(山东省科学院)山东省食品发酵工业研究设计院山东省食品发酵工程重点实验室山东济南250013

以SFR-3A为出发菌株,构建获得一株具有正反向筛选标记的菌株SFR-3A-ZMS;并通过该菌株和菌株SFR-4进行基因组重排,实现高抗逆性D-核糖高产菌株SFRCP-100的快速高效选育。在酵母浸粉、玉米浆及硫酸铵添加量分别为7.5 g/L、3 g/L及7 g/L的... 详细信息

以SFR-3A为出发菌株,构建获得一株具有正反向筛选标记的菌株SFR-3A-ZMS;并通过该菌株和菌株SFR-4进行基因组重排,实现高抗逆性D-核糖高产菌株SFRCP-100的快速高效选育。在酵母浸粉、玉米浆及硫酸铵添加量分别为7.5 g/L、3 g/L及7 g/L的优化氮源条件下,5 L发酵罐中D-核糖产量达到38.2 g/L,其转化率和整体生产效率分别达到35%和0.73 g/(L·h)。本实验成功添加正反向筛选标记,提高了基因组重排技术在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)优良菌株选育中的有效性和高效性。

关键词： D-核糖基因组重排枯草芽孢杆菌反向筛选标记

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纤维素降解梭菌遗传工具的开发

纤维素降解梭菌遗传工具的开发

作者：姜元元山西大学

学位级别：硕士

木质纤维素是世界上最丰富的可再生资源,高效处理和资源化利用木质纤维素对于人类社会的可持续发展有着非凡的意义。在自然界中,以解纤维梭菌(Ruminiclostridium cellulolyticum)和溶纸梭菌(Ruminiclostridium papyrosolvens)为代表的... 详细信息

木质纤维素是世界上最丰富的可再生资源,高效处理和资源化利用木质纤维素对于人类社会的可持续发展有着非凡的意义。在自然界中,以解纤维梭菌(Ruminiclostridium cellulolyticum)和溶纸梭菌(Ruminiclostridium papyrosolvens)为代表的产纤维小体梭菌,具有高效的木质纤维素降解能力,是潜在的利用整合生物加工技术(CBP)生产液体燃料的候选菌株。然而,这些菌株尤其是***的遗传改造手段相对缺乏,而且已有的技术仍存在一些缺陷,例如***质粒的转化需要体外甲基化和Clos Tron技术存在脱靶现象,这些缺陷严重阻碍了产纤维小体梭菌的基因工程改造,以及木质纤维素的生物转化技术的开发。本论文以***和***为研究对象,开发了一种质粒体内甲基化系统并实现了***中质粒的高效快速转化;另一方面,鉴定并筛选出能够在***中高效工作的诱导型启动子,这些工具的开发为纤维素降解梭菌的遗传改造奠定了基础。具体研究内容如下:I.构建***转化的体内甲基化系统原核生物中普遍存在一种生物免疫系统——限制修饰系统(Restriction-Modification system,RM system),能够区分自我/非自我的DNA成分,可以保护宿主免受外源DNA的侵害的。***中存在II型限制性内切酶Cce I,导致外源质粒无法直接转入。因此,现有的转化方法首先需要*** I甲基转移酶在体外对质粒进行甲基化。但是*** I甲基转移酶昂贵、容易失活且延长了转化时间。为了克服现有体外质粒甲基化方法的不足,我们克隆了源于***的*** I甲基转移酶基因(Ccel867),并筛选出了能功能性表达*** I甲基转移酶的大肠杆菌工程菌株。通过该工程菌株,我们实现了质粒的体内甲基化,并成功将该甲基化的外源质粒转化至***中。利用上述方法,将基于Clos Tron系统构建的限制性内切酶基因cce I敲除质粒成功转化到***中,并实现对cce I基因的插入突变。本研究中的一个难点在于如何使甲基转移酶基因在大肠杆菌中功能性表达。大肠杆菌存在Ⅳ型修饰依赖的限制性修饰系统如Mcr A,Mcr BC等,这些Ⅳ型系统能特异识别并剪切甲基修饰的DNA。因此,DNA甲基转移酶基因对于大肠杆菌来说是毒性基因。本研究中,我们尝试了许多宿主细胞,最终发现了能够表达来源于***的甲基转移酶的大肠杆菌HST08。***诱导型启动子的筛选及应用相对于***而言,***的进化程度更高,如其纤维小体中cip-cel基因簇的高度进化,暗示了其基因方面功能进化的更加完善。因此,探究该菌中的基因功能对于梭菌的生理研究具有重要的意义。但目前,该菌还缺乏一套完整的遗传体系,尤其是高效的诱导型启动子。首先,我们基于两种报告基因对两个外源梭菌诱导型启动子(来自***的阿拉伯糖诱导的启动子Para和***的乳糖诱导的Plac)和两个内源诱导型启动子(纤维二糖诱导的Pcel和木聚糖诱导的Pxyl)在***中进行启动子活性分析。结果表明内源启动子Pxyl和外源启动子Plac在***中具有很好的特异性和严谨性。Pxyl的诱导时间较短,仅需诱导4 h,启动子活性就能达到最高水平;而Plac达到最高水平的诱导剂浓度较低,仅需要0.1 g/L。利用Pxyl和Plac,我们成功构建了基于Maz F的反向选择筛选系统,能够实现质粒在***中可控丢失,该系统为***通过诱导质粒丢失来筛选突变体提供一个非常好的工具。总而言之,本研究开发了一个***转化的质粒体内甲基化系统,实现了***低成本的快速转化,同时在***中通过筛选到的高特异性和严谨性的诱导型启动子,构建了基于Maz EF的反向筛选系统并实现了质粒在***中可控丢失。这些研究为这类纤维素降解梭菌的遗传改造提供了便利条件。

关键词：解纤维梭菌溶纸梭菌限制修饰系统体内甲基化诱导型启动子反向筛选标记质粒丢失

spoOA基因缺失对克劳氏芽孢杆菌发酵性能的影响

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spoOA基因缺失对克劳氏芽孢杆菌发酵性能的影响

作者：周习旺齐鲁工业大学

学位级别：硕士

克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)是一株应用于工业化生产的高产碱性蛋白酶菌株,生产过程中芽孢的形成对后期的发酵和产酶有较大的影响,相对的增加了成本,降低了收益。利用基因组学和功能基因组学技术,分析芽孢形成过程中的基因调控机... 详细信息

克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)是一株应用于工业化生产的高产碱性蛋白酶菌株,生产过程中芽孢的形成对后期的发酵和产酶有较大的影响,相对的增加了成本,降低了收益。利用基因组学和功能基因组学技术,分析芽孢形成过程中的基因调控机制以及构建高产芽孢缺失型菌株成为可能,而芽孢的形成过程是一个多层次分阶段的过程,研究发现spoOA、kinA、kinB以及δ因子等基因在芽孢形成过程中起着重要作用。本文对碱性蛋白酶的基本特性、芽孢形成初始阶段的基因调控机制以及实验中采用的基因敲除技术进行了综合分析;实验中完成了对克劳氏芽孢杆菌的菌株特性、敲除了upp基因实现了反向筛选标记的构建、敲除了spoOA基因,分析spoOA基因对克劳氏芽孢杆菌的影响。主要的研究结果如下所示:1、针对该菌株不同于嗜碱芽孢杆菌的特性,本研究对克劳氏芽孢杆菌进行了16rDNA分析,按照基因组提取试剂盒提取基因组,PCR扩增出目标片段后送上海生工测序,将测序结果在GeneBank中BLAST比对,结果表明该菌株与克劳氏芽孢菌属重合度达到100%。同时对菌株的菌落形态、染色形态、培养条件、产酶、培养条件以及相关抗性等特性进行了分析。2、根据克劳氏芽孢杆菌转化效率较低的特点,利用温敏型质粒作为载体,进而实现该质粒在改变培养温度后复制状态转变成自杀质粒。在提取克劳氏芽孢杆菌的基因组后利用upp基因的上下游同源臂引物扩增两片段,再利用重叠PCR技术将上下游同源臂拼接,测序验证后连接于温敏型质粒pKSV7上,转化诱导后敲除了upp基因进而成功构建了upp缺失型菌株,实现了upp基因的无痕敲除和upp反向筛选标记的构建。实验中分析了upp敲除菌株的5-氟尿嘧啶抗性来验证该菌株是否具有反向筛选功能。3、以upp敲除菌株为宿主菌株,利用upp作为反向筛选标记并结合温敏型质粒pKSU敲除芽孢形成的关键基因spoOA,分析构建的ΔspoOA菌株产酶及其他的相关特性。其中,构建upp的缺失菌株作为敲除实验的初始菌株,质粒pKSU用来在42℃中获得单交换菌株,5-氟尿嘧啶用来筛选双交换菌株,通过PCR实验以及DNA测序验证正确敲除的目标菌株。结果表明芽孢的形成受到抑制,但是产酶状况及其它性能也受到较大的影响。

关键词：克劳氏芽孢杆菌反向筛选标记碱性蛋白酶 upp spo0A

丙酮丁醇梭菌纤维二糖转运系统的鉴定及其调控研究

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丙酮丁醇梭菌纤维二糖转运系统的鉴定及其调控研究

作者：田雅丽山西大学

学位级别：硕士

能源是人类赖以生存和发展的物质基础,但是随着能源过度的开发利用,对全球环境造成的污染问题越发严重,所以开发绿色无污染的可再生能源成为全球发展的共同需要。有着绿色能源之称的生物燃料受到各国政府以及研究学者的高度重视,其最大... 详细信息

能源是人类赖以生存和发展的物质基础,但是随着能源过度的开发利用,对全球环境造成的污染问题越发严重,所以开发绿色无污染的可再生能源成为全球发展的共同需要。有着绿色能源之称的生物燃料受到各国政府以及研究学者的高度重视,其最大的特点是燃烧和使用不会造成环境的污染,有利于维持生态环境的平衡。生物丁醇被认为是能量高并且有较好的燃料经济性的液体燃料,其生产来源是ABE(Acetone-Butanol-Ethanol)发酵。ABE发酵的主要生产菌株有丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum),拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)。其中丙酮丁醇梭菌能够利用各种单糖、二糖和多糖进行ABE发酵产生丁醇以及丙酮和乙醇等副产物。本研究以*** ATCC824为研究对象,对其纤维二糖转运系统及其调控机制进行了研究,主要研究工作以及结果如下:首先,我们通过文献调研和qPCR分析发现两个编码PTS(phosphotransferase system)系统基因簇(CAC0383-0386和CAC1407-1408)在纤维二糖下特异性高表达。利用ClosTron敲除技术分别将CAC0383和CAC1407插入失活以及将CAC0383和CAC1407共敲除,发现单突变体菌株和双突变体菌株中对应敲除基因的下游基因转录水平都有所降低;同时两个单突变体均可以利用纤维二糖,而共敲除CAC0383和CAC1407的双突变体不能利用纤维二糖。因此,*** ATCC824基因簇CAC0383-0386和CAC1407-1408均编码转运纤维二糖的PTSs(分别命名为PTS1和PTS2)。其次,我们对PTS1和PTS2可能转运的糖进行筛选。选择除了葡萄糖和纤维二糖以外的丙酮丁醇梭菌可以利用的二糖(蔗糖、乳糖)、戊糖(阿拉伯糖、木糖)、已糖(半乳糖)和多糖(木聚糖)进行生长比较,最终发现CAC0383基因被敲除的菌株不能利用半乳糖,而CAC1407基因被敲除时对半乳糖的生长没有影响,因此PTS1还负责半乳糖转运。最后,我们在***中成功建立了基于upp(编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶)的反向筛选系统。***Δupp确实能够在含有5-氟尿嘧啶(5-Fu)的培养基中生长,而将upp基因回补则不能生长。因此,可通过加入5-Fu快速实现含upp基因的质粒或片段丢失。同时,基于ClosTron敲除技术,建立将外源基因定点插入到基因组的目标位置的基因敲入技术。总而言之,该研究不仅鉴定了丙酮丁醇梭菌纤维二糖的转运系统和分析了其表达调控机制,同时将ClosTron和upp/5-Fu反向筛选系统结合开发了一个新的基因快速插入策略。这些研究不仅为丙酮丁醇梭菌高效利用木质纤维素奠定了基础,也为其他梭菌的遗传改造提供了便利条件。

关键词：丙酮丁醇梭菌 PTS转运系统纤维二糖 ClosTron 反向筛选标记尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因

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毕赤酵母直接基因敲除方法的研究

惠州学院学报 2014年第6期34卷 28-35页

作者：李莉玲广东惠州卫生职业技术学院药学系广东惠州516005

甲醇营养型巴斯德毕赤酵母已被广泛应用于外源蛋白的表达,但是作为一个外源蛋白表达系统,其还有待进一步完善。进一步提高外源蛋白的表达量以及形成折叠正确的目的蛋白,成为了改造毕赤酵母菌株的一个热点。基因缺失,是一个常用的改造和... 详细信息

甲醇营养型巴斯德毕赤酵母已被广泛应用于外源蛋白的表达,但是作为一个外源蛋白表达系统,其还有待进一步完善。进一步提高外源蛋白的表达量以及形成折叠正确的目的蛋白,成为了改造毕赤酵母菌株的一个热点。基因缺失,是一个常用的改造和构建新的毕赤酵母重组菌株常用的方法。巴斯德毕赤酵母直接基因缺失方法主要分为两类:有标记的插入替换和无标记的Pop-In/Pop-Out。本文系统地介绍了这两种方法,分别比较了各自的优缺点,为它们在巴斯德毕赤酵母中进行基因敲除提供了一定参考意义。

关键词：巴斯德毕赤酵母基因缺失反向筛选标记