利用sacB基因反向筛选法构建GFP分别融合于猪链球菌MapZ及PBP1b蛋白的融合菌株

作     者：卫东 陈平 高广娟 朱金鲁 武柳君 刘思国 张跃灵 WEI Dong;CHEN Ping;GAO Guang-juan;ZHU Jin-lu;WU Liu-jun;LIU Si-guo;ZHANG Yue-ling

作者机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069 

出 版 物：《中国预防兽医学报》 (Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine)

年 卷 期：2022年第44卷第11期

页      面：1149-1155页

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：国家重点研发计划(2021YFD1800401) 国家自然科学基金(32172853) 

主　　题：猪链球菌 无痕突变 sacB基因 反向筛选标记 

摘      要：为在猪链球菌(***)中引入高效的反向筛选标记,本研究根据***密码子偏好性优化了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)蔗糖果聚糖酶基因sacB的密码子,并由公司合成后作为模板,采用PCR扩增sacB基因片段;采用PCR从相应模板中分别扩增***中的启动子序列(Peno)及含壮观霉素抗性基因(spc)的片段;再经重叠延伸PCR扩增融合基因片段Peno-sacB-spc(PSS)。以相应模板及引物分别经PCR扩增*** mapZ基因待融合位点上下游序列UP1和DN1及其pbp1b基因待融合位点上下游序列UP2和DN2、含正/反向筛选标记的片段PSS1和PSS2基因片段,以及用于替换PSS片段的绿色荧光蛋白(GFP)gfp1和gfp2基因片段;再分别通过重叠延伸PCR扩增构建中间菌株的融合片段UP1-PSS1-DN1、UP2-PSS2-DN2以及构建GFP融合菌株的融合片段UP1-GFP1-DN1、UP2-GFP2-DN2。采用同源重组的方法将UP1-PSS1-DN1和UP2-PSS2-DN2分别转化*** 05ZYH33菌株,经壮观霉素筛选引入PSS的中间菌株。PCR及测序鉴定结果表明获得了引入PSS片段的中间菌株PSS-mapZ和PSS-pbp1b。将WT、PSS-mapZ和PSS-pbp1b分别培养于含不同浓度蔗糖(10%、7.5%、5%和2.5%)的TSAS平板上,确定WT生长而PSS-mapZ和PSS-pbp1b中间菌株不生长的蔗糖浓度(用于筛选及构建GFP融合菌株)。通过比较分析最终确定反向筛选GFP融合菌株的最适蔗糖浓度约为7%。通过同源重组的方法分别将UP1-GFP1-DN1片段转化PSS-mapZ菌株、UP2-GFP2-DN2片段转化PSS-pbp1b菌株,分别经含7%蔗糖(生长)及含壮观霉素(不生长)的TSAS平板筛选。随机选择经筛选获得的100个单菌落计算筛选的阳性率。各取6个单菌落经PCR及测序鉴定。结果显示,筛选菌株的阳性率在52%~75%。PCR及测序结果显示,获得的两种重组菌株中的gfp基因片段确实分别替换了PSS-mapZ和PSS-pbp1b中的相应PSS,表明正确构建了融合GFP的重组菌株GFP-mapZ和GFPpbp1b。本研究首次构建了高效的正/反向筛选标记PSS,以及无痕的*** GFP-mapZ和GFP-pbp1b融合菌株,为快速无痕的***遗传操作及深入研究***相关分子机制奠定了基础。