spoOA基因缺失对克劳氏芽孢杆菌发酵性能的影响

作     者：周习旺 

作者单位：齐鲁工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：肖静

授予年度：2017年

学科分类：0710[理学-生物学] 081703[工学-生物化工] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 090102[农学-作物遗传育种] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：克劳氏芽孢杆菌 反向筛选标记 碱性蛋白酶 upp spo0A 

摘      要：克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)是一株应用于工业化生产的高产碱性蛋白酶菌株,生产过程中芽孢的形成对后期的发酵和产酶有较大的影响,相对的增加了成本,降低了收益。利用基因组学和功能基因组学技术,分析芽孢形成过程中的基因调控机制以及构建高产芽孢缺失型菌株成为可能,而芽孢的形成过程是一个多层次分阶段的过程,研究发现spoOA、kinA、kinB以及δ因子等基因在芽孢形成过程中起着重要作用。本文对碱性蛋白酶的基本特性、芽孢形成初始阶段的基因调控机制以及实验中采用的基因敲除技术进行了综合分析;实验中完成了对克劳氏芽孢杆菌的菌株特性、敲除了upp基因实现了反向筛选标记的构建、敲除了spoOA基因,分析spoOA基因对克劳氏芽孢杆菌的影响。主要的研究结果如下所示:1、针对该菌株不同于嗜碱芽孢杆菌的特性,本研究对克劳氏芽孢杆菌进行了16rDNA分析,按照基因组提取试剂盒提取基因组,PCR扩增出目标片段后送上海生工测序,将测序结果在GeneBank中BLAST比对,结果表明该菌株与克劳氏芽孢菌属重合度达到100%。同时对菌株的菌落形态、染色形态、培养条件、产酶、培养条件以及相关抗性等特性进行了分析。2、根据克劳氏芽孢杆菌转化效率较低的特点,利用温敏型质粒作为载体,进而实现该质粒在改变培养温度后复制状态转变成自杀质粒。在提取克劳氏芽孢杆菌的基因组后利用upp基因的上下游同源臂引物扩增两片段,再利用重叠PCR技术将上下游同源臂拼接,测序验证后连接于温敏型质粒pKSV7上,转化诱导后敲除了upp基因进而成功构建了upp缺失型菌株,实现了upp基因的无痕敲除和upp反向筛选标记的构建。实验中分析了upp敲除菌株的5-氟尿嘧啶抗性来验证该菌株是否具有反向筛选功能。3、以upp敲除菌株为宿主菌株,利用upp作为反向筛选标记并结合温敏型质粒pKSU敲除芽孢形成的关键基因spoOA,分析构建的ΔspoOA菌株产酶及其他的相关特性。其中,构建upp的缺失菌株作为敲除实验的初始菌株,质粒pKSU用来在42℃中获得单交换菌株,5-氟尿嘧啶用来筛选双交换菌株,通过PCR实验以及DNA测序验证正确敲除的目标菌株。结果表明芽孢的形成受到抑制,但是产酶状况及其它性能也受到较大的影响。