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双链rna依赖的蛋白激酶在放射性肺损伤中的作用及机制研究

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临床急诊杂志 2015年第9期16卷 672-677页

作者：柳云恩佟昌慈张玉彪施琳金红旭高燕侯明晓沈阳军区总医院急诊医学部全军重症(战)创伤救治中心实验室辽宁省重症创伤和器官保护重点实验室沈阳110016

目的:探讨双链rna依赖的蛋白激酶(PKR)在放射性肺损伤中的作用和分子机制。方法:将20只雄性SD大鼠随机分成对照组和放射组,对照组不做任何处理,放射组大鼠左肺一次性给予20Gy照射,观察1个月。人肺泡上皮细胞(HPAEpiC)分别转染高、低表达... 详细信息

目的:探讨双链rna依赖的蛋白激酶(PKR)在放射性肺损伤中的作用和分子机制。方法:将20只雄性SD大鼠随机分成对照组和放射组,对照组不做任何处理,放射组大鼠左肺一次性给予20Gy照射,观察1个月。人肺泡上皮细胞(HPAEpiC)分别转染高、低表达的PKR后,给予15Gy照射。采用支气管肺泡灌洗液的分析、Masson染色、免疫组织化学、MTT法、Real-time PCR和Western blot等方法研究PKR在放射性肺损伤中的作用及机制。结果:与对照组比较,放射组大鼠体重明显较低,肺/体重比值明显较高(Prna和蛋白水平明显高于对照组,且抗凋亡因子Bcl-2mrna和蛋白水平显著低于对照组(P蛋白表达水平明显低于对照组,而p-PKR蛋白表达水平明显高于对照组(P蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达显著低于正常细胞照射组,而促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达显著高于正常细胞照射组(P蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达显著高于正常细胞照射组,而促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达显著低于正常细胞照射组(P<0.05)。结论:放射可以导致严重的肺损伤,肺损伤发生机制可能与PKR通路有关。

关键词：放射肺损伤凋亡双链rna依赖的蛋白激酶

双链rna依赖的蛋白激酶(PKR)的真核表达、纯化及鉴定

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安徽农业科学 2009年第28期37卷 13521-13523页

作者：关振宏李影张茂林段铭吉林大学人兽共患病教育部重点实验室人兽共患病研究所吉林长春130062 吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118

[目的]获得真核表达的Flag-PKR融合蛋白,以用于流感病毒相关的PKR信号通路调控机制研究。[方法]以RT-PCR方法扩增PKR目的基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0-Flag中。将所构建的重组质粒pcDNA3.0-Flag-PKR转染293T细胞,利用Flag抗体... 详细信息

[目的]获得真核表达的Flag-PKR融合蛋白,以用于流感病毒相关的PKR信号通路调控机制研究。[方法]以RT-PCR方法扩增PKR目的基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0-Flag中。将所构建的重组质粒pcDNA3.0-Flag-PKR转染293T细胞,利用Flag抗体偶联的琼脂糖凝胶(anti-Flag M2-Agarose)纯化Flag-PKR融合蛋白,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot及体外活性鉴定。[结果]重组质粒转染293T细胞,Western blot显示表达出的融合蛋白能够被抗Flag的抗体特异性识别,其相对分子量约为69 kDa,与Flag-PKR融合蛋白大小相符;体外磷酸化试验表明,Flag-PKR融合蛋白能够发生自动磷酸化。[结论]在293T细胞中表达、纯化了有活性的Flag-PKR融合蛋白,为PKR信号通路的研究奠定了基础。

关键词：流感病毒双链rna依赖的蛋白激酶真核表达纯化

宫颈病变中双链rna依赖的蛋白激酶与HPV感染的相关性

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国际妇产科学杂志 2009年第6期36卷 476-478,F0003页

作者：李蕾瞿全新天津市黄河医院妇产科 300420 天津市第一中心医院

目的:通过检测双链rna依赖的蛋白激酶(PKR)、人乳头瘤病毒(HPV)在宫颈病变组织中的表达,探讨PKR在宫颈病变发生发展中的意义及可能机制。方法:选择临床病历资料和病理资料完整的宫颈癌患者共37例、同期宫颈上皮内瘤样病变(CIN)Ⅰ～Ⅲ患... 详细信息

目的:通过检测双链rna依赖的蛋白激酶(PKR)、人乳头瘤病毒(HPV)在宫颈病变组织中的表达,探讨PKR在宫颈病变发生发展中的意义及可能机制。方法:选择临床病历资料和病理资料完整的宫颈癌患者共37例、同期宫颈上皮内瘤样病变(CIN)Ⅰ～Ⅲ患者56例为研究对象,因子宫肌瘤等良性病变切除子宫的正常宫颈组织30例为对照。采用免疫组织化学SABC法检测PKR及HPV16/18E6的表达,分析二者与宫颈病变发生发展的关系。结果:宫颈癌组织中PKR表达阳性率为54.1%,高于CINⅢ,CINⅠ～Ⅱ组和正常宫颈组,差异有统计学意义(P<0.05);在宫颈癌组中PKR表达与HPV16/18E6表达存在负相关(r=-0.554,P<0.05);在CINⅢ组中PKR表达与HPV16/18E6表达存在正相关(r=0.480,P=0.032)。结论:PKR的异常表达在CINⅢ向宫颈癌发展过程中可能发挥主要作用,此外SABC法测定PKR和E6的表达有可能成为筛选子宫颈癌的早期指标。

关键词：双链rna依赖的蛋白激酶人乳头瘤病毒宫颈上皮内瘤样病变宫颈癌免疫组织化学

丙型肝炎病毒核心蛋白对双链rna依赖蛋白激酶活性的影响

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中华肝脏病杂志 2014年第8期22卷 590-593页

作者：张丹冯国和中国医科大学附属盛京医院感染科沈阳110021

目的探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白对双链rna依赖的蛋白激酶（PKR）活性的影响。方法将表达HCV核心蛋白的真核表达质粒pCMH6K—Core转染人肝癌细胞系BEL-7402，应用干扰素（IFN）。α-2b诱导内源性PKR的表达及活化，利用Western blo... 详细信息

目的探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白对双链rna依赖的蛋白激酶（PKR）活性的影响。方法将表达HCV核心蛋白的真核表达质粒pCMH6K—Core转染人肝癌细胞系BEL-7402，应用干扰素（IFN）。α-2b诱导内源性PKR的表达及活化，利用Western blot检测核心蛋白对PKR磷酸化的影响；将荧光素酶质粒pGL3-Promoter与不同剂量的pCMH6K—Core共转染BEL-7402细胞，进行荧光素酶活性检测，以反映核心蛋白对细胞蛋白合成的影响。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间均数比较用t检验或单因素方差分析。结果在IFNα-2b刺激下，表达HCV核心蛋白的BEL-7402细胞中，PKR的磷酸化水平明显低于空白质粒转染组和未转染组，而3组总PKR的表达水平无明显差别。在共转染荧光素酶质粒与核心蛋白表达质粒的BEL-7402细胞中，荧光素酶活性较共转染空白质粒组增强，且荧光素酶潘性的增高与核心蛋白的表达量呈剂量依赖效应，0．5μg、1．0μg和1．5μg的pCMH6K-Core转染组荧光素酶活性分别为空白质粒组的（1．941士0．199）倍、（2．868±0．275）倍和（3．839±0．338）倍，各组比较，P值均＜0．05。结论在人肝癌细胞系BEL-7402中，HCV核心蛋白能够抑制内源性PKR的活性，从而促进细胞蛋白合成。

关键词：肝炎病毒丙型病毒核心蛋白质类双链rna依赖的蛋白激酶

双链rna激活的蛋白激酶(PKR)的克隆表达及其对丙型肝炎病毒蛋白合成的抑制作用

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中国生物化学与分子生物学报 2006年第1期22卷 24-30页

作者：贾因棠魏来蒋栋丛旭费然北京大学人民医院肝病研究所北京100044

α干扰素为治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的主要药物,但部分患者呈干扰素耐受而不能获得持久的病毒阴转,其可能的原因之一是病毒通过其编码的蛋白(NS5A及E2)抑制干扰素诱导的抗病毒效应分子———双链rna激活的蛋白激酶(PKR)的活性.而关于... 详细信息

α干扰素为治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的主要药物,但部分患者呈干扰素耐受而不能获得持久的病毒阴转,其可能的原因之一是病毒通过其编码的蛋白(NS5A及E2)抑制干扰素诱导的抗病毒效应分子———双链rna激活的蛋白激酶(PKR)的活性.而关于PKR是否在IFN-α抗HCV的机理中起抑制作用目前仍有争议.为研究PKR对HCV蛋白合成环节是否有抑制作用,通过构建野生型PKR真核表达载体(pPKRwt)及主要起负性调节作用的缺失突变PKR真核表达载体(pPKRΔ6),并将pPKRwt/pPKRΔ6与HCV复制子rna同时转染Huh7细胞进行共表达,用Western印迹检测HCV IRES下游的NPTⅡ蛋白表达水平,与转染空载体的对照细胞及单用IFN-α处理的细胞相比较.结果显示:表达PKRwt的细胞中NPTⅡ蛋白水平低于转染空载体的对照细胞,但高于经IFN-α单独处理的细胞;表达PKRΔ6的细胞中NPTⅡ蛋白水平与对照细胞无明显差别,但PKRΔ能部分抵消IFN-α的抑制作用,说明在IFN-α抑制HCV IRES指导的蛋白合成中,PKR有一定的抑制作用,但可能还有其它的PKR非依赖机制参与.

关键词：双链rna依赖的蛋白激酶丙型肝炎病毒复制子 α干扰素内部核糖体进入位点

口蹄疫病毒3C蛋白降解蛋白激酶PKR促进病毒复制的分子机制

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口蹄疫病毒3C蛋白降解蛋白激酶PKR促进病毒复制的分子机制

作者：李春天中国农业科学院

学位级别：硕士

口蹄疫是口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的对家畜及多种野生动物高度致病的烈性传染病。天然免疫反应在宿主抵御FMDV早期感染过程中发挥着关键作用,是宿主抵御病毒感染的第一道防线,广谱、及时地识别病原微生物感... 详细信息

口蹄疫是口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的对家畜及多种野生动物高度致病的烈性传染病。天然免疫反应在宿主抵御FMDV早期感染过程中发挥着关键作用,是宿主抵御病毒感染的第一道防线,广谱、及时地识别病原微生物感染并启动机体的免疫反应;同时天然免疫也能诱导机体起始适应性免疫应答,并对适应性免疫反应具有关键地调控作用。双链rna依赖的蛋白激酶(PKR)在宿主抵抗病毒感染中发挥着重要的作用。为了阐明PKR在FMDV感染过程中的作用,我们首先开展了PKR的过表达实验,结果表明过表达PKR,FMDV的复制水平明显受到抑制;这证明PKR具有抑制FMDV复制的功能。我们进一步对FMDV感染后PKR在细胞水平内表达情况进行了研究,结果表明,FMDV感染PK15细胞后,PKR的转录水平逐渐升高,但其蛋白水平及磷酸化水平则显著降低;PKR介导激活的eIF2α磷酸化水平也受到明显的抑制。通过进一步研究,发现FMDV非结构蛋白3C是FMDV感染细胞后抑制PKR表达降低其磷酸化的关键病毒蛋白。为了阐明3C下调PKR蛋白表达的机制,我们通过蛋白质的互作、构建突变体、蛋白质降解途径抑制等方法进行了系统研究。结果表明FMDV 3C不能与宿主PKR发生互作,其水解酶活性与PKR表达水平的降低并不存在关联,3C是通过溶酶体途径来下调PKR的表达;但对于其具体如何调控溶酶体路径的机制还有待于进一步阐明。总之,通过本研究的开展,我们证实了宿主PKR抑制FMDV的功能,发现FMDV感染能够抑制宿主PKR蛋白表达;同时,我们发现FMDV拮抗PKR抗病毒作用的一种新机制,即FMDV的非结构蛋白3C通过调控溶酶体途径下调PKR蛋白的表达水平,从而拮抗PKR的抗病毒作用。本研究为阐明FMDV拮抗宿主抗病反应的分子机制提供新的数据,为降低FMDV疫苗免疫抑制性提供新的视角。

关键词：口蹄疫病毒双链rna依赖的蛋白激酶 3Cpro 溶酶体路径

PKR在恶性黑素瘤中的表达和作用的初步研究

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PKR在恶性黑素瘤中的表达和作用的初步研究

作者：高滢第四军医大学

学位级别：硕士

一、目的明确PKR在MM中的表达状况和PKR在MM中的作用,为进一步深入研究通过调控PKR系统为MM患者提供个体化、多元化的治疗打下基础。二、方法 1.采用免疫组化方法对42例MM石蜡保存组织和25例普通痣细胞痣组织中PKR的表达... 详细信息

一、目的明确PKR在MM中的表达状况和PKR在MM中的作用,为进一步深入研究通过调控PKR系统为MM患者提供个体化、多元化的治疗打下基础。二、方法 1.采用免疫组化方法对42例MM石蜡保存组织和25例普通痣细胞痣组织中PKR的表达水平进行检测和比较,并分析MM中PKR表达水平与MM患者临床病理参数之间的关系;2.采用Western—blotting方法对MM细胞系与MC细胞中PKR、p—PKR和p58的表达水平进行检测和比较;3.采用免疫组化方法对42例MM石蜡保存组织中PKR的表达水平和细胞增殖程度进行检测,并分析MM中PKR表达水平与细胞增殖程度之间的相关性;4.在体外实验中应用外源性药物,改变MM细胞系中PKR的表达水平和活化水平,采用Western—blotting和免疫荧光方法检测PKR的表达水

关键词：黑素瘤痣双链rna依赖的蛋白激酶细胞增殖:凋亡

万安玻璃红鲤鱼PKR的克隆鉴定与系统进化分析

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井冈山大学学报（自然科学版） 2021年第6期42卷 35-40页

作者：罗辉陈洁邵敏曾菲万力朱圆玉胡有生井冈山大学医学部江西吉安343009 吉安县疾病预防控制中心江西吉安县343100 南昌大学抚州医学院江西抚州344000

本研究以万安玻璃红鲤鱼为材料,通过同源克隆的方法克隆了万安玻璃红鲤鱼双链rna激活的蛋白激酶(PKRCcvwPKR),并首次克隆到CcvwPKR的剪接异构体。CcvwPKR全长为2145 bp,编码714个氨基酸,CcvwPKR剪接异构体全长1431 bp,编码476个氨基酸。... 详细信息

本研究以万安玻璃红鲤鱼为材料,通过同源克隆的方法克隆了万安玻璃红鲤鱼双链rna激活的蛋白激酶(PKRCcvwPKR),并首次克隆到CcvwPKR的剪接异构体。CcvwPKR全长为2145 bp,编码714个氨基酸,CcvwPKR剪接异构体全长1431 bp,编码476个氨基酸。CcvwPKR的剪接异构体是CcvwPKR第477个密码子的G突变为T(gaa477taa),从而使得CcvwPKR的翻译提前终止。氨基酸序列比对和空间结构SMART预测显示,CcvwPKR和CcvwPKR剪接异构体都含有三个双链rna结合模体(dsRBM),CcvwPKR剪接异构体缺失PKR的C端的激酶结构域。系统进化分析表明,万安玻璃红鲤鱼PKR在进化上与鲤鱼和鲫鱼密切相关。万安玻璃红鲤鱼和目前已有研究的鲤科鱼类PKR一样,分子结构都含有三个dsRBM,三个dsRBM使得其具有更强的结合dsrna的作用,推测可能与其较强的抗病能力有关。

关键词：万安玻璃红鲤鱼双链rna依赖的蛋白激酶基因克隆基因鉴定