双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)的真核表达、纯化及鉴定

作     者：关振宏 李影 张茂林 段铭 

作者机构：吉林大学人兽共患病教育部重点实验室人兽共患病研究所吉林长春130062 吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 

出 版 物：《安徽农业科学》 (Journal of Anhui Agricultural Sciences)

年 卷 期：2009年第37卷第28期

页      面：13521-13523页

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 0828[工学-农业工程] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(30800824) 吉林大学农学部引进人才启动基金项目(4305050102B9) 

主　　题：流感病毒 双链RNA依赖的蛋白激酶 真核表达 纯化 

摘      要：[目的]获得真核表达的Flag-PKR融合蛋白,以用于流感病毒相关的PKR信号通路调控机制研究。[方法]以RT-PCR方法扩增PKR目的基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0-Flag中。将所构建的重组质粒pcDNA3.0-Flag-PKR转染293T细胞,利用Flag抗体偶联的琼脂糖凝胶(anti-Flag M2-Agarose)纯化Flag-PKR融合蛋白,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot及体外活性鉴定。[结果]重组质粒转染293T细胞,Western blot显示表达出的融合蛋白能够被抗Flag的抗体特异性识别,其相对分子量约为69 kDa,与Flag-PKR融合蛋白大小相符;体外磷酸化试验表明,Flag-PKR融合蛋白能够发生自动磷酸化。[结论]在293T细胞中表达、纯化了有活性的Flag-PKR融合蛋白,为PKR信号通路的研究奠定了基础。