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双硫仑通过调控miR-1258表达抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭

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沈阳药科大学学报 2022年第8期39卷 963-969页

作者：李存素周明辉董云昆明市第三人民医院医学工程部云南昆明650041 昆明理工大学药学院云南昆明650093 昆明市西山区妇幼保健计划生育服务中心云南昆明650100

目的探讨双硫仑对胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响和可能机制。方法不同浓度的双硫仑处理胃癌细胞AGS后,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活力,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-1258表达水平。将miR... 详细信息

目的探讨双硫仑对胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响和可能机制。方法不同浓度的双硫仑处理胃癌细胞AGS后,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活力,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-1258表达水平。将miR-1258模拟物转染AGS细胞,检测上调miR-1258对AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响。将miR-1258抑制物转染AGS细胞,检测下调miR-1258对双硫仑处理的AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果双硫仑处理后AGS细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著降低,miR-1258表达显著升高,并呈显著的量效关系(P双硫仑对AGS细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用,恢复细胞增殖、迁移和侵袭能力(P双硫仑对胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭具有抑制作用,其机制与上调miR-1258表达有关。

关键词：双硫仑胃癌增殖迁移和侵袭 miR-1258

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双硫仑协同奥沙利铂诱导胃癌细胞铁死亡

安徽医科大学学报 2022年第9期57卷 1453-1458页

作者：喻鑫刘弋周波曹先东安徽医科大学第一附属医院胃肠外科合肥230022

目的探讨双硫仑(DSF)协同奥沙利铂(O_(xa))联合用药对胃癌细胞BGC-823的协同抑制作用。方法CCK-8实验检测细胞活力,CompuSyn软件做Fraction-Effect协同作用曲线评价联用效果;AnnexinV/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡率;碘化吡啶(PI)染色... 详细信息

目的探讨双硫仑(DSF)协同奥沙利铂(O_(xa))联合用药对胃癌细胞BGC-823的协同抑制作用。方法CCK-8实验检测细胞活力,CompuSyn软件做Fraction-Effect协同作用曲线评价联用效果;AnnexinV/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡率;碘化吡啶(PI)染色流式细胞术检测细胞死亡率;染色流式细胞术检测脂质过氧化自由基(LipROS)水平变化;qRT-PCR检测铁死亡标记物PTGS2、GPX4、SLC7A11的mRNA表达水平变化。结果DSF与O_(xa)单用或联合用药可通过时间和剂量依赖性抑制胃癌细胞BGC-823增殖,两药联用可发挥明显协同作用,诱导BGC-823胃癌细胞凋亡和铁死亡。DSF与O_(xa)联用可诱导LipROS合成增多,导致促铁死亡调控基因PTGS2 mRNA表达水平明显上升,抑铁死亡调控基因GPX4、SLC7A11的mRNA表达水平明显下降。结论DSF与O_(xa)联用可抑制胃癌BGC-823细胞活力,引起BGC-823细胞凋亡和铁死亡。

关键词：胃癌双硫仑奥沙利铂协同作用铁死亡

双硫仑调控RIPK1依赖的细胞坏死改善急性胰腺炎的作用机制研究

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双硫仑调控RIPK1依赖的细胞坏死改善急性胰腺炎的作用机制研究

作者：黄秋洋重庆理工大学

学位级别：硕士

研究背景:急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一种常见的腹部炎症性疾病,急性胰腺炎由多种病因引起,如胆结石继发的胰管梗阻、酒精、内窥镜逆行胰胆管造影术和各种药物等。多种因素引起腺泡细胞内信号异常和细胞器功能障碍,最终导致... 详细信息

研究背景:急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一种常见的腹部炎症性疾病,急性胰腺炎由多种病因引起,如胆结石继发的胰管梗阻、酒精、内窥镜逆行胰胆管造影术和各种药物等。多种因素引起腺泡细胞内信号异常和细胞器功能障碍,最终导致腺泡细胞死亡和局部和全身炎症。尽管急性胰腺炎的发病率和死亡率逐年升高,但急性胰腺炎的治疗现状仍差强人意,迫切需要特效药的出现。双硫仑作为FDA批准的戒酒药,在临床上应用广泛。双硫仑主要通过抑制NLRP3炎症小体活化、Gasdermin D蛋白膜孔形成、中性粒细胞胞外捕网的形成及释放、抑制核转录因子-kappa B激活等机制,抑制炎症反应并改善炎性相关疾病。因此双硫仑是一种对炎症性疾病具有潜在治疗作用的药物。研究目的:双硫仑作为一种戒酒药,并且具有抗炎效果,但该药物在急性胰腺炎中的作用并不明确。在本项研究中,我们旨在研究双硫仑对急性胰腺炎的作用,并探讨其具体分子机制。研究方法:本研究首先利用牛磺胆酸钠、雨蛙素或者L-精氨酸诱导小鼠胰腺腺泡细胞坏死,加入Hoechst与PI(propidium iodide)染色,荧光显微镜拍照并统计细胞的坏死率。其次,腹腔注射9次雨蛙素(每小时注射一次)构建雨蛙素诱导的急性胰腺炎模型,并在注射完雨蛙素前0小时时与10小时灌胃给药双硫仑,收集其胰腺组织,利用H&E染色观察胰腺水肿、炎性因子浸润与坏死的病理情况并评分,检测胰腺组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)与胰蛋白酶原的活性。此外,腹腔注射2次L-精氨酸-盐酸盐(每小时注射一次)构建重症急性胰腺炎小鼠模型,统计小鼠死亡率,收集其胰腺组织,利用H&E染色观察胰腺病理情况并评分。本研究还采用网络药理学收集双硫仑-急性胰腺炎以及急性胰腺炎中细胞坏死相关靶点,并通过交集筛选出共同靶点。随后,在筛选出的共同靶点基础上,利用分子对接和分子动力学模拟等方法,探索双硫仑抗细胞坏死的潜在分子靶点。最后,本研究采用蛋白免疫印迹、免疫组化与逆转录荧光定量PCR的方法,验证双硫仑对改善急性胰腺炎腺泡细胞坏死的作用机制。研究结果:结果表明,双硫仑可显著抑制由相关毒剂诱导的腺泡细胞坏死,表现为胰腺腺泡细胞坏死率降低。在动物模型中,双硫仑可明显改善由雨蛙素诱导的急性胰腺炎胰腺组织坏死,并且降低胰腺组织中MPO与胰蛋白酶活性。同时,双硫仑也可改善由L-精氨酸诱导的重症急性胰腺炎小鼠胰腺组织坏死。通过网络药理学,筛选出双硫仑抗急性胰腺炎细胞坏死潜在靶点,并通过分子对接与分子动力学模拟发现双硫仑与RIPK1表现出较强亲和力,提示RIPK1可能是双硫仑预防腺泡细胞坏死的有效靶点。q RT-PCR分析显示,在雨蛙素与牛磺胆酸钠诱导的腺泡细胞坏死模型中,RIPK1的m RNA水平显著升高,双硫仑干预组的RIPK1的m RNA水平显著降低,同时,雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠模型组中,胰腺中RIPK1的m RNA水平显著升高,而在药双硫仑治疗组中,RIPK1 m RNA水平明显下调。蛋白免疫印迹结果显示,在雨蛙素与牛磺胆酸钠诱导的腺泡细胞坏死模型中,RIPK与MLKL蛋白水平显著升高,双硫仑干预组的RIPK1与MLKL的蛋白水平显著降低,同时,雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠模型组中,胰腺中RIPK1与MLKL的蛋白水平显著升高,而在药双硫仑治疗组中,RIPK1与MLKL蛋白水平明显下调。此外,蛋白免疫印迹结果显示,雨蛙素诱导的腺泡细胞坏死模型中,胞质中NF-κB p65的蛋白水平下调,胞核中的NF-κB p65的蛋白水平上调,而在双硫仑干预下,显著显著上调了胞质中NF-κB p65的蛋白水平,下调胞核中的NF-κB p65的蛋白水平。双硫仑还可以减少坏死腺泡细胞释放的损伤相关分子所诱导的中性粒细胞胞外捕获网的形成,同时减少胰腺组织中TLR4的蛋白表达。结论:双硫仑可以通过抑制RIPK1的m RNA和蛋白水平表达减少腺泡细胞坏死。双硫仑抑制在雨蛙素刺激下的胰腺腺泡细胞NF-κB p65组分的移位。并且双硫仑可抑制中性粒细胞胞外捕获网的产生,下调TLR4蛋白水平,从而抑制炎性反应,改善急性胰腺炎。

关键词：细胞坏死双硫仑 RIPK1 急性胰腺炎 NF-κB

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双硫仑在炎症相关疾病中作用的研究进展

华西药学杂志 2023年第1期38卷 117-122页

作者：黄秋洋陈小中戴晨余秀燕沈燕林治华重庆理工大学药学与生物工程学院重庆400054 重庆理工大学、药物化学与分子药理学重点实验室、靶向药物筛选与活性评价重点实验室重庆400054

双硫仑作为FDA批准的戒酒药在临床上被广泛使用。双硫仑主要通过抑制NLRP3炎症小体活化、Gasdermin D蛋白膜孔形成、中性粒细胞胞外捕网的形成及释放、抑制核转录因子κB激活等机制,抑制炎症反应并改善炎性相关疾病。此外,双硫仑与其他... 详细信息

双硫仑作为FDA批准的戒酒药在临床上被广泛使用。双硫仑主要通过抑制NLRP3炎症小体活化、Gasdermin D蛋白膜孔形成、中性粒细胞胞外捕网的形成及释放、抑制核转录因子κB激活等机制,抑制炎症反应并改善炎性相关疾病。此外,双硫仑与其他药物联合使用可提升其抗炎作用。现对双硫仑抗炎作用的分子机制及其在炎性疾病中的作用进行综述,以期为双硫仑作为抗炎药物的应用提供参考。

关键词：双硫仑炎症反应 NLRP3炎症小体 Gasdermin D蛋白中性粒细胞胞外捕网核转录因子κB 抗炎作用分子机制

双硫仑通过表观遗传调节PD-L1表达并提高PD-1单抗疗效的机制研究

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双硫仑通过表观遗传调节PD-L1表达并提高PD-1单抗疗效的机制研究

作者：郑欣华中科技大学

学位级别：硕士

【目的】探索双硫仑对三阴性乳腺癌中PD-L1的表达和肿瘤免疫微环境的影响及其作用机制。【方法】1.利用生物信息学分析DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)在乳腺癌和正常乳腺组织中的差异表达。同时,用实时定量PCR、Weste... 详细信息

【目的】探索双硫仑对三阴性乳腺癌中PD-L1的表达和肿瘤免疫微环境的影响及其作用机制。【方法】1.利用生物信息学分析DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)在乳腺癌和正常乳腺组织中的差异表达。同时,用实时定量PCR、Western blot检测不同的浓度的双硫仑处理后的三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和BT-549细胞内DNMT1表达量和活性的改变。2.利用GEPIA2网站,首先分析了三阴性乳腺癌病人和正常组织中的干扰素调节因子7(Interferon regulatory factor 7,IRF7)表达水平的差异。本研究提取了TCGA数据库中1217个乳腺癌病人的测序转录组的相关数据和临床相关信息,计算了IRF7基因整体甲基化状态以及启动子区域甲基化水平。同时分析了IRF7基因表达水平与乳腺癌病人IRF7甲基化和临床特征之间相关性。体外实验部分,本研究对双硫仑处理后的三阴性乳腺癌细胞系进行了IRF7启动子区域甲基化水平的检测。同时,检测了双硫仑处理后的三阴性乳腺癌细胞系中IRF7的转录以及蛋白水平的改变。3.本研究利用TCGA中乳腺癌病人数据,进行PD-L1与IRF7的转录水平相关性分析。然后通过流式细胞术、实时定量PCR、Western blot验证了不同浓度的双硫仑对PD-L1的表达水平的调控作用。4.在体内实验,本研究利用乳腺癌鼠源细胞系4T1构建了乳腺癌皮下瘤模型来探究双硫仑对肿瘤的生长、肿瘤免疫微环境的调节及双硫仑联合PD-1单抗的抗肿瘤效果。首先将小鼠分为空白对照组、双硫仑单药治疗组、PD-1单抗治疗组、双硫仑联合PD-1单抗治疗组,分别进行不同的药物干预。然后比较了四组小鼠瘤体的体积大小,通过免疫组化检测了四组小鼠肿瘤组织中CD3、CD4、CD8、PD-L1、Granzyme B免疫浸润相关分子以及DNMT1、IRF7的变化。5.最后,对小鼠皮下瘤肿瘤组织进行转录组组测序。接着利用四组测序数据计算各组免疫浸润水平评分,同时筛选差异基因进行基因功能富集、GSEA分析。【结果】1.利用GEPIA2数据库对比135个三阴性乳腺癌病人样本和112个正常乳腺组织,本研究发现在乳腺癌组织中,DNMT1处于较高的表达状态。不同浓度的双硫仑处理三阴性乳腺癌细胞系后发现DNMT1在转录以及蛋白水平都会显著下调,同时双硫仑还可以显著抑制DNMT1的活性。2.对比乳腺癌病人样本和正常乳腺组织,IRF7的转录水平没有差异性。通过对TCGA数据库中1217个乳腺癌病人转录组的数据和临床信息分析发现:IRF7基因整体甲基化水平以及启动子区域的甲基化水平与IRF7的表达呈负相关。BSP实验证明,双硫仑处理后IRF7启动子区域发生去甲基化调节,Western blot结果和实时定量PCR结果显示,双硫仑处理可以显著促进IRF7转录及蛋白表达。3.通过TGCA数据库的分析,本研究发现IRF7的表达水平和PD-L1呈正相关。并且流式细胞术、实时定量PCR、Western blot检测双硫仑处理后的PD-L1的转录、总蛋白表达和膜蛋白表达水平均上调。4.在体内实验中,本研究发现双硫仑联合PD-1单抗治疗组的皮下瘤体积明显小于其他单药治疗组。免疫组化的结果显示联合治疗组的免疫浸润相关分子(CD3、CD4、CD8、PD-L1、Granzyme B)的表达水平明显高于其他组,而双硫仑处理会诱导抑制性免疫微环境。在免疫组化的结果中,联合组的DNMT1较其他组是低表达,IRF7是高表达,与体外实验中结果一致。5.分析小鼠皮下瘤转录组测序显示:双硫仑联合PD-1单抗治疗组的免疫浸润程度高,而双硫仑组免疫浸润低。通过GO和KEGG分析,本研究发现双硫仑单药治疗组在Th1和Th2细胞分化、抗原处理和呈递相关等免疫相关通路响应减弱。通过GSEA分析,结果显示联合处理组在Th1和Th2细胞分化、抗原加工和呈现、自然杀伤细胞的介导、细胞毒性和T细胞受体信号转导这四个免疫相关功能增强。【结论】双硫仑在三阴性乳腺癌中可上调PD-L1的表达产生免疫逃逸而降低肿瘤的免疫浸润程度。双硫仑通过下调DNMT1的表达及活性,从而使IRF7的发生去甲基化并上调IRF7的表达水平进而促进PD-L1表达,产生的免疫负向调控作用。双硫仑联合PD-1单抗治疗可以阻断免疫逃逸促进肿瘤免疫浸润并产生更强的抗肿瘤效应,这为三阴性乳腺癌的治疗提供了新的思路。

关键词：双硫仑三阴性乳腺癌免疫检查点阻断 PD-L1 表观遗传学

双硫仑联合藤黄抑制肠癌肝转移的活性与机制研究

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双硫仑联合藤黄抑制肠癌肝转移的活性与机制研究

作者：张东东北林业大学

学位级别：硕士

肠癌(colorectal cancer,CRC)是目前发病率较高的恶性肿瘤。CRC主要转移部位为肝脏,因绝大多数肠癌肝转移患者已不可根治手术,化疗成为了主要手段。目前以卡培他滨为基础的三联药物(卡培他滨+奥沙利铂+亚叶酸)是治疗肠癌肝转移的一线药... 详细信息

肠癌(colorectal cancer,CRC)是目前发病率较高的恶性肿瘤。CRC主要转移部位为肝脏,因绝大多数肠癌肝转移患者已不可根治手术,化疗成为了主要手段。目前以卡培他滨为基础的三联药物(卡培他滨+奥沙利铂+亚叶酸)是治疗肠癌肝转移的一线药物,但其毒副作用大,且易耐药,因此,急需发展一线药物耐药后高效低毒的新药。基于双硫仑或藤黄均具有治疗肠癌的潜能,本研究首先通过体内外实验评估双硫仑联合藤黄抗肠癌肝转移的活性与毒性,然后探究了双硫仑与藤黄协同抗肿瘤活性的机制。研究结果如下:1.双硫仑联合藤黄抑制肠癌肝转移的体外活性研究:(1)采用MTT法测定双硫仑联合藤黄抑制小鼠肠癌细胞CT26.WT增殖实验:加药孵育48 h后,双硫仑组、藤黄组、双硫仑联合藤黄组和阳性对照组的IC值分别为42.23μg/m L、29.54μg/m L、16.91μg/m L和9.64μg/m L。加药孵育72 h后,双硫仑组、藤黄组、双硫仑联合藤黄组和阳性对照组的IC值分别为30.71μg/m L、25.11μg/m L、12.06μg/m L和7.78μg/m L。根据实验结果推测:双硫仑联合藤黄组体外抗肿瘤活性可能优于双硫仑或藤黄单一用药组,且随着用药时间的延长药效增强。(2)采用细胞划痕(修复)法测定双硫仑联合藤黄抑制小鼠肠癌细胞CT26.WT迁移实验:阴性对照组、双硫仑组、藤黄组、双硫仑联合藤黄组和阳性对照组的细胞迁移率分别为:24.92±0.85%、18.79±0.56%、16.25±0.65%、5.53±0.37%、7.73±0.76%,根据实验结果推测:双硫仑与藤黄联用组的细胞划痕修复能力最弱,抑制细胞迁移的能力最强,与其他各组相比均具有显著性差异(n=3,**P双硫仑联合藤黄抑制肠癌肝转移的体内活性研究:(1)肠癌肝转移模型小鼠平均生存期:阴性对照组、双硫仑组、藤黄组、双硫仑联合藤黄组和阳性对照组模型小鼠的平均生存期分别为(18.00±1.41)d、(21.83±2.79)d、(23.33±3.08)d、(26.83±2.99)d和(27.17±3.66)d。根据实验结果推测:双硫仑联合藤黄组比双硫仑或藤黄单一给药组的平均生存期均延长,且具有显著性差异(n=6,**P0.05)。(2)肠癌肝转移模型小鼠体重变化:给药组小鼠体重增长速度比阴性对照组缓慢,双硫仑联合藤黄组小鼠造模前后体重变化不明显,阳性对照组小鼠造模前后体重有所降低,根据实验结果推测:双硫仑联合藤黄组与阳性对照组相比毒性相对较小。(3)肿瘤抑制率与协同作用测定:给药组的平均肝重都小于阴性对照组,双硫仑联合藤黄组的平均肝重小于双硫仑或藤黄单一用药组,具有显著性差异(n=6,**P0.05);双硫仑组、藤黄组、双硫仑联合藤黄组和卡培他滨组肿瘤抑制率分别为16.38%、27.87%、47.41%和44.41%;经过金氏公式测定q=1.19,说明双硫仑与藤黄联用抑制肠癌肝转移产生了协同作用。(4)HE染色肝脏病理观察:模型小鼠肝脏分布了大小不等的灰白色肿瘤结节,对肝脏组织进行HE染色病理切片分析,阴性对照组肿瘤病灶数量较多,肿瘤细胞DNA复制较为活跃,双硫仑组、藤黄组和双硫仑联合藤黄组肿瘤病灶数量依次减少,阳性对照组癌细胞分布最为疏松,细胞成团数量最少,根据实验结果推测双硫仑联合藤黄对肠癌肝转移具有良好的抑制作用。(5)组织切片药物毒性分析:与空白组小鼠相比,双硫仑联合藤黄组组织切片未见明显变化,对小鼠器官影响较小;卡培他滨组(阳性对照组)小鼠部分组织器官出现了病理变化,可能与其毒性较大有关。3.双硫仑联合藤黄抑制肠癌肝转移的机制研究:(1)双硫仑和藤黄在体内的代谢过程:双硫仑和藤黄在人工胃液中形成的化合物进行质谱定性分析,得到m/z777.27离子和m/z742.97离子。双硫仑和藤黄联用药物胃液转化物作用于肿瘤细胞后成分进行质谱定性分析,得到m/z629.30、m/z651.27、m/z148.08等离子。根据实验结果推测:双硫仑和藤黄进入胃液后,双硫仑在酸性条件下二硫键断裂生成二乙基二硫代氨基甲酸(DDC),与藤黄主要成分藤黄酸发生迈克尔加成反应生成新的脂溶性化合物,该化合物作用于肿瘤细胞后,又被分解为双硫仑和藤黄酸,避免了藤黄酸可能与肠道内亚硫酸盐等结合形成水溶性较大的衍生物排出,提高了双硫仑和藤黄酸的药物作用。(2)双硫仑与藤黄联用对CT26.WT肿瘤细胞铜总量的影响:原子吸收光谱法测定空白组、双硫仑组和双硫仑联合藤黄组的光密度值分别为102.5、218.4和147.1,根据实验结果推测:藤黄可能是通过促进CT26.WT肿瘤细胞Cu外排,使肿瘤细胞铜离子耗竭,与双硫仑螯合铜离子协同作用抑制肿瘤细胞生长(

关键词：双硫仑藤黄肠癌肝转移联合用药

双硫仑联合铜通过下调EIF5A2抑制胃癌细胞增殖、迁移以及胃癌干细胞特性

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双硫仑联合铜通过下调EIF5A2抑制胃癌细胞增殖、迁移以及胃癌干细...

作者：王晨山东大学

学位级别：硕士

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,根据国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)发布的2020全球癌症统计数据,胃癌居全球癌症发病谱的第5位与死因谱的第4位。此外,胃癌的粗发病率在东亚地区(39.1/10万)最高... 详细信息

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,根据国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)发布的2020全球癌症统计数据,胃癌居全球癌症发病谱的第5位与死因谱的第4位。此外,胃癌的粗发病率在东亚地区(39.1/10万)最高。在我国,由于目前胃癌的早期诊断率仍较低,大多数患者在首次就医时便已经为进展期的胃癌。虽然临床上针对胃癌的手术联合放化疗治疗策略得到了一定的发展,但是由于传统化疗药物不可避免的毒副作用,大概率的化疗耐药以及肿瘤的复发和转移等问题存在,胃癌患者的远期预后仍未能达到预期。近年来,随着肿瘤干细胞研究的深入,胃癌干细胞也逐渐被证实。胃癌干细胞(Gastric Cancer Stem Cell,GCSC)是一类特殊的恶性肿瘤细胞群,表现出较强的自我更新能力以及多向分化潜能。研究发现,胃癌干细胞与胃癌的复发、转移和化疗耐药等生物学行为存在密切联系。因此,靶向胃癌干细胞有望成为能够从根源上治疗胃癌的有效策略。真核翻译起始因子SA2(Eukaryotic Initiation Factor 5A2,EIF5A2)是近年来发现的在许多人类肿瘤的进展及预后判断中发挥重要作用的候选癌基因之一。然而,EIF5A2在胃癌干细胞中是否具有特异性表达,以及EIF5A2在胃癌发生发展过程中的作用尚不完全清楚。通过对胃癌干细胞功能及其相关分子机制的研究,寻找新的胃癌分子标志物,将有助于胃癌的早期诊断,并为改善胃癌患者预后带来更多希望。双硫仑(Disulfiram,DSF)是一种能够抑制乙醛脱氢酶(ALDH)活性从而被用作抗酒精依赖的药物。近年来发现,双硫仑还表现出显著的抗肿瘤作用,并呈现铜离子依赖性,对黑色素瘤、脑胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌以及肺癌等具有潜在的靶向作用。双硫仑价格低廉,作为戒酒药用于临床已有70多年的历史,在临床使用中报告的不良反应极少,用药风险低。由于低成本、低毒以及肿瘤组织趋向性等独特优势,双硫仑老药新用作为临床抗肿瘤药物具有广阔前景。目前,双硫仑对于胃癌的抗肿瘤活性仅少量文献涉及,相关分子机制尚未阐明。本课题旨在探究DSF/Cu对胃癌细胞生物学特性的作用及其分子机制,为胃癌治疗提供更多可选择的策略及理论基础。本课题的主要内容包括以下三个部分:(1)DSF/Cu对胃癌细胞的体外作用;(2)DSF/Cu对胃癌细胞的体内作用;(3)DSF/Cu抑制胃癌细胞增殖、迁移以及胃癌干细胞特性的分子机制。DSF/Cu对于胃癌细胞的体外作用研究包括其对于胃癌细胞增殖以及凋亡的影响、对胃癌细胞迁移能力的影响以及对胃癌干细胞特性的影响。首先通过MTT、克隆形成实验初步评价双硫仑的抗肿瘤活性,结果证实DSF/Cu呈剂量依赖性抑制胃癌细胞SGC-7901、MGC-803的增殖;利用流式细胞术对细胞凋亡率进行检测,结果显示DSF/Cu使SGC-7901、MGC-803两株胃癌细胞凋亡率显著升高,并且进一步的Western Blot结果显示DSF/Cu降低Caspase-3蛋白水平的同时上调Cleaved-caspase-3的蛋白水平,证实DSF/Cu能够诱导胃癌细胞凋亡;划痕实验、Transwell迁移实验结果证实DSF/Cu能够显著抑制胃癌细胞SGC-7901、MGC-803的迁移能力;通过Western Blot以及qRT-PCR检测胃癌干细胞标志物表达水平的变化,结果表明DSF/Cu呈剂量依赖性抑制胃癌细胞SGC-7901中干细胞标志物ALDH1A1的蛋白表达,并且下调了 SGC-7901、MGC-803两株胃癌细胞中干细胞转录因子Oct-4、Nanog、Sox-2的蛋白表达以及mRNA水平,证实DSF/Cu能够抑制胃癌干细胞特性;进一步通过悬浮克隆球形成实验筛选胃癌干细胞,结果显示DSF/Cu能够抑制胃癌干细胞形成克隆球的能力,进一步证实DSF/Cu对胃癌干细胞特性的抑制作用。DSF/Cu对胃癌细胞的体内作用通过裸鼠皮下成瘤实验(皮下注射SGC-7901)以及裸鼠尾静脉转移实验(尾静脉注射MKN-45)进行探究。每四天记录瘤体体积,约一个月后取瘤,分别测量阴性对照组(NC)以及实验组(DSF/Cu)瘤体的重量以及体积,并将瘤体组织进行Ki67免疫组化染色,结果证实DSF/Cu能够抑制体内胃癌细胞的增殖,下调Ki67的蛋白表达水平;通过裸鼠尾静脉转移实验并取裸鼠肺组织进行HE染色,结果显示DSF/Cu给药后裸鼠肺部转移灶显著减少,且病灶体积明显减小,证实DSF/Cu能够抑制体内胃癌细胞的转移;利用Western Blot、qRT-PCR检测裸鼠皮下瘤组织中干细胞转录因子Oct-4、Nanog、Sox-2的蛋白表达水平以及mRNA水平,结果表明DSF/Cu能够显著抑制体内胃癌干细胞特性。为进一步探究DSF/Cu抗胃癌作用的分子机制,首先评价其对于EIF5A2表达水平的影响。悬浮克隆

关键词：胃癌胃癌干细胞双硫仑 EIF5A2

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双硫仑对小鼠放射性肠损伤的防护作用研究

双硫仑对小鼠放射性肠损伤的防护作用研究

作者：袁青文锦州医科大学

学位级别：硕士

目的研究双硫仑对小鼠电离辐射引起的放射性肠损伤的防护作用,初步探究其防护机制。方法本研究采用12 Gy X射线全身辐照C57BL/6小鼠,建立放射性肠损伤模型;给药组小鼠在照射前1小时腹腔注射100 mg/kg双硫仑,对照组给予相应体积的对照溶... 详细信息

目的研究双硫仑对小鼠电离辐射引起的放射性肠损伤的防护作用,初步探究其防护机制。方法本研究采用12 Gy X射线全身辐照C57BL/6小鼠,建立放射性肠损伤模型;给药组小鼠在照射前1小时腹腔注射100 mg/kg双硫仑,对照组给予相应体积的对照溶剂,观察小鼠照射后14天生存率,并记录其体重变化;通过苏木红-伊红染色观察小肠组织结构变化;通过Brd U(5-Bromo-2’-deoxyuridine,5-溴-2’-脱氧尿苷)掺入法检测小肠隐窝细胞增殖;使用Lgr5-e GFP-IRES-Cre ERT2;Rosa26-Td Tomato和Bmi1-Cre ER;Rosa26-YFP小鼠谱系追踪X射线照射后Lgr5+细胞以及Bmi1+细胞的表达。采用TUNEL、Cleaved caspase 3、γH2AX免疫组化检测隐窝细胞凋亡及DNA(Deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸)损伤;通过蛋白质免疫印迹实验检测X射线照射后隐窝细胞γH2AX蛋白表达变化。结果照射前1小时腹腔注射100 mg/kg双硫仑,不仅显著延长全身照射后小鼠存活时间,提高腹部照射小鼠的生存率,促进绒毛结构恢复。双硫仑预处理可抑制照射后24小时内隐窝细胞增殖,但促进照射后3.5天小肠隐窝细胞再生,而且减少照射后24小时隐窝内TUNEL、Cleaved caspase 3阳性细胞以及异常增殖细胞数量。另外双硫仑抑制照射后7天的Lgr5+以及Bmi1+细胞减少。免疫组化和蛋白质免疫印迹实验显示双硫仑显著抑制辐照后γH2AX的表达。结论双硫仑可能通过阻滞细胞周期而促进小肠干细胞DNA损伤修复、减少细胞凋亡从而促进后期隐窝细胞的快速增殖,进一步促进隐窝-上皮结构恢复,以此减轻放射性肠损伤,提高小鼠存活率。

关键词：双硫仑放射防护剂放射性肠损伤 Lgr5+干细胞 DNA损伤

双硫仑通过调控MYC蛋白表达抑制弥漫大B细胞淋巴瘤生长的机制研究

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双硫仑通过调控MYC蛋白表达抑制弥漫大B细胞淋巴瘤生长的机制研究

作者：文秋月华中科技大学

学位级别：硕士

目的:具有MYC和BCL2蛋白共表达的弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)又称为双表达淋巴瘤(double expressor lymphoma,DEL),这类患者预后较差。目前已有靶向BCL2的商品化药物Venetoclax(ABT-199),而针对MYC的抑制剂由于其蛋白质结构具有不可成药性... 详细信息

目的:具有MYC和BCL2蛋白共表达的弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)又称为双表达淋巴瘤(double expressor lymphoma,DEL),这类患者预后较差。目前已有靶向BCL2的商品化药物Venetoclax(ABT-199),而针对MYC的抑制剂由于其蛋白质结构具有不可成药性,直接靶向MYC蛋白的药物极难研发。本研究旨在探索在临床上已成熟应用超过60年的“老药”双硫仑(disulfiram,DSF)的新用途,探讨它对MYC的调控作用和对DLBCL抑制作用的相关机制。方法:(1)利用生物信息学分析MYC和BCL2在弥漫大B细胞淋巴瘤中的差异表达。(2)通过CCK8增殖实验和流式细胞术检测DSF对MYC过表达的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系SU-DHL2和SU-DHL4增殖和凋亡的影响。(3)用Western blot实验和实时定量PCR检测双硫仑对SU-DHL2和SU-DHL4细胞MYC和BCL2的调控作用。并通过RNA-seq测序分析DSF处理后差异基因的变化、MYC以及已知相关基因的表达情况。(4)免疫共沉淀、泛素化和半衰期实验检测DSF对MYC蛋白的影响。并通过双荧光酶实验检测DSF对MYC翻译起始的影响。(5)体内动物实验验证DSF对MYC过表达的DLBCL的影响。结果:(1)使用GEPIA2网站对比了TCGA数据库中47个DLBCL样本和337个正常淋巴组织样本的转录组测序,结果发现MYC在DLBCL中的高表达和临床预后相关。(2)CCK8实验显示DSF抑制MYC过表达DLBCL细胞的增殖,同时流式细胞术显示DSF还促进细胞的凋亡。(3)Western blot实验和实时定量PCR证实DSF明显抑制DLBCL细胞中MYC蛋白的表达,但不影响其转录。而DSF对BCL2的转录和蛋白表达都没有调控作用。(4)RNA-seq测序结果显示DSF使MYC相关基因的表达降低,泛素化相关的基因表达增高。这提示我们DSF对MYC具有调控作用,这种调控机制可能是通过泛素化蛋白酶体依赖的途径实现的。其次,RNA-seq测序差异基因热图显示DSF明显抑制e IF4H m RNA水平,提示DSF影响e IF4H下游基因的转录后的翻译水平。(5)免疫共沉淀显示DSF促进MYC的泛素化积聚,从而促进MYC蛋白的降解,缩短其半衰期。(6)通过Ubi Browser网站分析发现Fbxw7是MYC的E3连接酶,过表达Fbxw7质粒后,DSF对MYC蛋白表达的抑制作用增强,并增多了MYC的泛素化积聚。(7)Western blot实验显示DSF抑制翻译起始因子e IF4H的表达进而下调MYC的表达。回复实验显示体外过表达e IF4H质粒后,DSF对MYC蛋白表达的抑制作用减小。(8)双荧光素酶实验证实DSF明显抑制MYC的帽依赖翻译。(9)体内动物实验表明DSF明显抑制MYC过表达DLBCL的生长。结论:DSF可以靶向调控MYC蛋白表达从而抑制MYC过表达的DLBCL的生长。DSF之所以能下调MYC的表达,一方面,它通过激活Fbxw7蛋白表达,诱导MYC的泛素化降解;另一方面DSF通过负向调控翻译起始因子e IF4H,抑制帽依赖的翻译从而减少MYC蛋白的合成。这些发现为DSF治疗MYC过表达的DLBCL提供了新的理论依据。

关键词：弥漫大B细胞淋巴瘤双硫仑 MYC蛋白翻译起始因子泛素化降解