双硫仑通过调控MYC蛋白表达抑制弥漫大B细胞淋巴瘤生长的机制研究

作     者：文秋月 

作者单位：华中科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张利玲

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：弥漫大B细胞淋巴瘤 双硫仑 MYC蛋白 翻译起始因子 泛素化降解 

摘      要：目的:具有MYC和BCL2蛋白共表达的弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)又称为双表达淋巴瘤(double expressor lymphoma,DEL),这类患者预后较差。目前已有靶向BCL2的商品化药物Venetoclax(ABT-199),而针对MYC的抑制剂由于其蛋白质结构具有不可成药性,直接靶向MYC蛋白的药物极难研发。本研究旨在探索在临床上已成熟应用超过60年的“老药双硫仑(disulfiram,DSF)的新用途,探讨它对MYC的调控作用和对DLBCL抑制作用的相关机制。方法:(1)利用生物信息学分析MYC和BCL2在弥漫大B细胞淋巴瘤中的差异表达。(2)通过CCK8增殖实验和流式细胞术检测DSF对MYC过表达的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系SU-DHL2和SU-DHL4增殖和凋亡的影响。(3)用Western blot实验和实时定量PCR检测双硫仑对SU-DHL2和SU-DHL4细胞MYC和BCL2的调控作用。并通过RNA-seq测序分析DSF处理后差异基因的变化、MYC以及已知相关基因的表达情况。(4)免疫共沉淀、泛素化和半衰期实验检测DSF对MYC蛋白的影响。并通过双荧光酶实验检测DSF对MYC翻译起始的影响。(5)体内动物实验验证DSF对MYC过表达的DLBCL的影响。结果:(1)使用GEPIA2网站对比了TCGA数据库中47个DLBCL样本和337个正常淋巴组织样本的转录组测序,结果发现MYC在DLBCL中的高表达和临床预后相关。(2)CCK8实验显示DSF抑制MYC过表达DLBCL细胞的增殖,同时流式细胞术显示DSF还促进细胞的凋亡。(3)Western blot实验和实时定量PCR证实DSF明显抑制DLBCL细胞中MYC蛋白的表达,但不影响其转录。而DSF对BCL2的转录和蛋白表达都没有调控作用。(4)RNA-seq测序结果显示DSF使MYC相关基因的表达降低,泛素化相关的基因表达增高。这提示我们DSF对MYC具有调控作用,这种调控机制可能是通过泛素化蛋白酶体依赖的途径实现的。其次,RNA-seq测序差异基因热图显示DSF明显抑制e IF4H m RNA水平,提示DSF影响e IF4H下游基因的转录后的翻译水平。(5)免疫共沉淀显示DSF促进MYC的泛素化积聚,从而促进MYC蛋白的降解,缩短其半衰期。(6)通过Ubi Browser网站分析发现Fbxw7是MYC的E3连接酶,过表达Fbxw7质粒后,DSF对MYC蛋白表达的抑制作用增强,并增多了MYC的泛素化积聚。(7)Western blot实验显示DSF抑制翻译起始因子e IF4H的表达进而下调MYC的表达。回复实验显示体外过表达e IF4H质粒后,DSF对MYC蛋白表达的抑制作用减小。(8)双荧光素酶实验证实DSF明显抑制MYC的帽依赖翻译。(9)体内动物实验表明DSF明显抑制MYC过表达DLBCL的生长。结论:DSF可以靶向调控MYC蛋白表达从而抑制MYC过表达的DLBCL的生长。DSF之所以能下调MYC的表达,一方面,它通过激活Fbxw7蛋白表达,诱导MYC的泛素化降解;另一方面DSF通过负向调控翻译起始因子e IF4H,抑制帽依赖的翻译从而减少MYC蛋白的合成。这些发现为DSF治疗MYC过表达的DLBCL提供了新的理论依据。