双硫仑调控RIPK1依赖的细胞坏死改善急性胰腺炎的作用机制研究

作     者：黄秋洋 

作者单位：重庆理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：沈燕

授予年度：2023年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：细胞坏死 双硫仑 RIPK1 急性胰腺炎 NF-κB 

摘      要：研究背景:急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一种常见的腹部炎症性疾病,急性胰腺炎由多种病因引起,如胆结石继发的胰管梗阻、酒精、内窥镜逆行胰胆管造影术和各种药物等。多种因素引起腺泡细胞内信号异常和细胞器功能障碍,最终导致腺泡细胞死亡和局部和全身炎症。尽管急性胰腺炎的发病率和死亡率逐年升高,但急性胰腺炎的治疗现状仍差强人意,迫切需要特效药的出现。双硫仑作为FDA批准的戒酒药,在临床上应用广泛。双硫仑主要通过抑制NLRP3炎症小体活化、Gasdermin D蛋白膜孔形成、中性粒细胞胞外捕网的形成及释放、抑制核转录因子-kappa B激活等机制,抑制炎症反应并改善炎性相关疾病。因此双硫仑是一种对炎症性疾病具有潜在治疗作用的药物。研究目的:双硫仑作为一种戒酒药,并且具有抗炎效果,但该药物在急性胰腺炎中的作用并不明确。在本项研究中,我们旨在研究双硫仑对急性胰腺炎的作用,并探讨其具体分子机制。研究方法:本研究首先利用牛磺胆酸钠、雨蛙素或者L-精氨酸诱导小鼠胰腺腺泡细胞坏死,加入Hoechst与PI(propidium iodide)染色,荧光显微镜拍照并统计细胞的坏死率。其次,腹腔注射9次雨蛙素(每小时注射一次)构建雨蛙素诱导的急性胰腺炎模型,并在注射完雨蛙素前0小时时与10小时灌胃给药双硫仑,收集其胰腺组织,利用H&E染色观察胰腺水肿、炎性因子浸润与坏死的病理情况并评分,检测胰腺组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)与胰蛋白酶原的活性。此外,腹腔注射2次L-精氨酸-盐酸盐(每小时注射一次)构建重症急性胰腺炎小鼠模型,统计小鼠死亡率,收集其胰腺组织,利用H&E染色观察胰腺病理情况并评分。本研究还采用网络药理学收集双硫仑-急性胰腺炎以及急性胰腺炎中细胞坏死相关靶点,并通过交集筛选出共同靶点。随后,在筛选出的共同靶点基础上,利用分子对接和分子动力学模拟等方法,探索双硫仑抗细胞坏死的潜在分子靶点。最后,本研究采用蛋白免疫印迹、免疫组化与逆转录荧光定量PCR的方法,验证双硫仑对改善急性胰腺炎腺泡细胞坏死的作用机制。研究结果:结果表明,双硫仑可显著抑制由相关毒剂诱导的腺泡细胞坏死,表现为胰腺腺泡细胞坏死率降低。在动物模型中,双硫仑可明显改善由雨蛙素诱导的急性胰腺炎胰腺组织坏死,并且降低胰腺组织中MPO与胰蛋白酶活性。同时,双硫仑也可改善由L-精氨酸诱导的重症急性胰腺炎小鼠胰腺组织坏死。通过网络药理学,筛选出双硫仑抗急性胰腺炎细胞坏死潜在靶点,并通过分子对接与分子动力学模拟发现双硫仑与RIPK1表现出较强亲和力,提示RIPK1可能是双硫仑预防腺泡细胞坏死的有效靶点。q RT-PCR分析显示,在雨蛙素与牛磺胆酸钠诱导的腺泡细胞坏死模型中,RIPK1的m RNA水平显著升高,双硫仑干预组的RIPK1的m RNA水平显著降低,同时,雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠模型组中,胰腺中RIPK1的m RNA水平显著升高,而在药双硫仑治疗组中,RIPK1 m RNA水平明显下调。蛋白免疫印迹结果显示,在雨蛙素与牛磺胆酸钠诱导的腺泡细胞坏死模型中,RIPK与MLKL蛋白水平显著升高,双硫仑干预组的RIPK1与MLKL的蛋白水平显著降低,同时,雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠模型组中,胰腺中RIPK1与MLKL的蛋白水平显著升高,而在药双硫仑治疗组中,RIPK1与MLKL蛋白水平明显下调。此外,蛋白免疫印迹结果显示,雨蛙素诱导的腺泡细胞坏死模型中,胞质中NF-κB p65的蛋白水平下调,胞核中的NF-κB p65的蛋白水平上调,而在双硫仑干预下,显著显著上调了胞质中NF-κB p65的蛋白水平,下调胞核中的NF-κB p65的蛋白水平。双硫仑还可以减少坏死腺泡细胞释放的损伤相关分子所诱导的中性粒细胞胞外捕获网的形成,同时减少胰腺组织中TLR4的蛋白表达。结论:双硫仑可以通过抑制RIPK1的m RNA和蛋白水平表达减少腺泡细胞坏死。双硫仑抑制在雨蛙素刺激下的胰腺腺泡细胞NF-κB p65组分的移位。并且双硫仑可抑制中性粒细胞胞外捕获网的产生,下调TLR4蛋白水平,从而抑制炎性反应,改善急性胰腺炎。