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原阿片碱对转化生长因子β1诱导的人角膜基质成纤维细胞的抑制作用研究

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原阿片碱对转化生长因子β1诱导的人角膜基质成纤维细胞的抑制作...

作者：杨钰涵贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:原阿片碱是贵州苗药“消疤草”的主要活性成分之一,具有抗炎、抗肿瘤、肝纤维化等活性作用。鉴于抗纤维化这一特性,本实验拟通过研究原阿片碱对转化生长因子β1诱导的体外人角膜基质成纤维细胞的影响,探讨原阿片碱是否具有抗人角... 详细信息

目的:原阿片碱是贵州苗药“消疤草”的主要活性成分之一,具有抗炎、抗肿瘤、肝纤维化等活性作用。鉴于抗纤维化这一特性,本实验拟通过研究原阿片碱对转化生长因子β1诱导的体外人角膜基质成纤维细胞的影响,探讨原阿片碱是否具有抗人角膜基质纤维化的潜能,为“消疤草”开发利用提供科学理论依据。方法:从全飞秒激光小切口透镜摘除术(Small Incision Lenticule Extraction,SMILE)中获取人角膜基质进行原代提取,细胞培养及浓度为2.5ng/mL TGF-β1纤维化诱导。实验分为对照组、HCF组、低(200 μmol/L)、中(400 μmol/L)、高(800 μmol/L)浓度原阿片碱组。作用24小时后,共聚焦显微镜下观察细胞生长情况,TGF-β1诱导及PTP抑制后的细胞形态;CCK-8法检验细胞增殖抑制情况;流式细胞术检测细胞凋亡率;实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(Real time-PCR,RT-PCR)测定α-SMA(α-Smoothmuscleactin,α-SMA)、角质蛋白(Keratocan)、基膜聚糖(Lumican)、乙醛脱氢酶(ALDH3)、波形蛋白(Vimentin,VIM)、纤连蛋白(Fibronectin,FN)mRNA的相对表达量;Western Blot检测细胞中α-SMA、FN、基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白诱导因子(Extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN)的蛋白相对表达量。结果:显微镜下可观察到在原代提取进行至第五天时,细胞开始围绕组织爬出,形态多呈多边形;第十天见细胞铺满瓶底,可行细胞传代。TGF-β1诱导24小时后细胞形态可见为长梭形。在共聚焦显微镜下可观察到HCF组α-SMA、Fibronectin表达明显增高,呈强阳性。RT-PCR结果显示与HK组相比,HCF细胞中Keratocan mRNA相对表达量减少,α-SMA、FN、VimmRNA相对表达量增高,差异具有显著性(P0.05),低、中、高浓度对Lumican和ALDH3的表达无明显作用。Western blot结果显示低、中、高浓度PTP组细胞中α-SMA、Fibronectin、MMP-2及EMMPRIN蛋白表达量明显低于TGF-β1组,差异具有统计学意义(P原阿片碱可抑制TGF-β1诱导的角膜基质成纤维细胞的增殖并促进其凋亡。(③原阿片碱可通过抑制EMMPRIN-MMPs的表达,缓解细胞外基质的沉积重塑,从而影响纤维化过程。④原阿片碱可抑制TGF-β1促进的人角膜基质成纤维细胞转化,从而影响人角膜基质纤维化的发展过程。

关键词：原阿片碱人角膜基质细胞人角膜基质成纤维细胞人角膜基质纤维化转化生长因子-β1

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原阿片碱调节破骨细胞生成的相关机制研究

原阿片碱调节破骨细胞生成的相关机制研究

作者：黄王利延安大学

学位级别：硕士

研究背景:骨质疏松症（osteoporosis）是由多种原因引起的以骨密度和骨质量下降,骨微结构破坏为特征的全身性骨骼疾病,易使患者发生髋部、脊柱和其他部位的骨折。作为全世界的一个主要公共卫生问题,骨质疏松症随着世界人口的老龄化而日... 详细信息

研究背景:骨质疏松症（osteoporosis）是由多种原因引起的以骨密度和骨质量下降,骨微结构破坏为特征的全身性骨骼疾病,易使患者发生髋部、脊柱和其他部位的骨折。作为全世界的一个主要公共卫生问题,骨质疏松症随着世界人口的老龄化而日益普遍。由于人口的老龄化,其带来的的社会和经济负担正在稳步增加。临床上用于治疗骨质疏松症的药物主要有抗骨吸收类药物如双膦酸盐类、促骨形成类药物如甲状旁腺素PTH（1-34）及双重作用类药物如雷奈酸锶。然而,每种药物都有其局限性,如一定的副作用或价格昂贵。例如,作为一线药物的双膦酸盐,有引起颌骨坏死、严重肌肉骨骼疼痛、食道癌和肾衰竭的副作用。此外,这些药物对年龄相关的、激素相关的和其他类型的骨质疏松症的疗效较差。因此,开发安全有效的治疗骨质疏松症的药物势在必行。天然植物提取物作为一种潜在的预防和治疗人类疾病的药物,因其取材广泛、副作用较小的特点近年来受到了越来越多的关注。原阿片碱是一种异喹啉生物碱,作为一种植物单体,它的众多的药理作用已被人们所发掘,如:抗炎、抗血小板聚集、抗癌、镇痛、血管扩张、抗胆碱酯酶、抗成瘾、抗惊厥、抗病原体、抗氧化、保肝、神经保护、细胞毒性和抗增殖活性作用,但是原阿片碱在骨重建及破骨细胞中的药理作用仍没有被人探索。目的:利用核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞。利用该模型探索原阿片碱在体外对破骨细胞生成的可能作用及具体机制,同时为因破骨细胞过度分化所导致的骨质疏松等疾病提供新的可能的治疗思路,为植物单体原阿片碱的进一步的体内外研究提供一定的依据及参考。方法:利用破骨细胞特异性染色TRAP染色实验鉴定RANKL（50ng/ml）诱导RAW264.7细胞形成的破骨细胞,并且评价不同浓度原阿片碱（0,5,10,20μM）对RANKL（50ng/ml）诱导的破骨细胞生成的作用。在指定的时间点向含有RANKL（50ng/ml）的RAW264.7细胞中加入原阿片碱（20μM）,通过TRAP染色探究原阿片碱发挥对破骨细胞分化抑制作用的具体时间点。通过CCK-8实验来探究不同浓度的原阿片碱（0,5,10,20μM）对RAW264.7细胞活力的影响。采用罗丹明-鬼笔环肽染色实验来探究不同浓度原阿片碱（0,5,10,20μM）对RANKL（50ng/ml）诱导的破骨细胞F-肌动蛋白环的作用。利用Real-time PCR实验从基因方面分析不同浓度原阿片碱（0,5,10,20μM）对破骨细胞形成至关重要的转录因子NFATc1和c-Fos及破骨细胞特异性基因TRAP,Cathepsin K（Cts K）,ATP6V0d2和MMP-9的作用。利用蛋白印迹试验分析不同浓度原阿片碱（0,5,10,20μM）对关键转录因子NFATc1和cFos及破骨细胞特异性标志物TRAP,Cathepsin K（Cts K）,ATP6V0d2和MMP-9蛋白表达的作用;分析原阿片碱（20μM）对破骨细胞生成过程中关键信号分子NF-κB（IκB、p65）及MAPKs（JNK、ERK、p38）蛋白表达的作用。所有的实验单独重复三次,所有实验结果均以平均值±标准差的形式表示。所获得的实验数据用Graph Pad Prism（第8版）软件进行单因素方差分析和Student’s t检验,*p＜0.05被认为具有统计学意义。结果:成功搭建RANKL诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞的模型。原阿片碱以剂量依赖性（0,5,10,20μM）的方式抑制RANKL诱导的破骨细胞的生成且对RAW264.7细胞的活力无影响,且其主要在破骨细胞生成的早期阶段发挥抑制作用。原阿片碱也以剂量依赖性的方式抑制RANKL诱导的破骨细胞F-肌动蛋白环的形成。从基因层面及蛋白质表达层面,原阿片碱以剂量依赖性的方式抑制了RANKL诱导的破骨细胞关键转录因子NFATc1及c-Fos和破骨细胞特异性标志物TRAP,Cathepsin K（Cts K）,ATP6V0d2和MMP-9的表达。最后,原阿片碱在不同的时间点抑制了破骨细胞生成过程中关键信号分子IκB、NF-κB p65、JNK、ERK、p38的磷酸化。结论:我们的研究表明,作为延胡索的主要成分之一,原阿片碱通过抑制NF-κB和MAPKs信号通路以及破骨细胞特异性转录因子NFATc1和c-Fos,抑制了破骨细胞特异性标志物TRAP、Cts K、MMP-9和ATP6V0d2的表达,最终抑制了RANKL诱导的RAW264.7细胞向破骨细胞的分化。因此,原阿片碱作为破骨细胞分化的抑制剂,对于由破骨细胞过度活跃引起的疾病,如骨质疏松症等,具有潜在的治疗前景。

关键词：原阿片碱 RANKL NF-κB MAPKs 破骨细胞生成

超声波辅助优化博落回根原阿片碱、别隐品碱提取工艺的研究

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饲料研究 2023年第5期46卷 86-90页

作者：李光伟黄明浩黄泰奇武汉东湖学院生命科学与化学学院湖北武汉430212 武汉科技大学医学院湖北武汉430065

试验旨在使用超声波辅助优化博落回根原阿片碱、别隐品碱的提取工艺。采用单因素试验筛选提取工艺中的时间、液料比、提取次数的最佳条件,通过正交试验确定最佳提取条件;采用硅胶层析纯化原阿片碱、别隐品碱,使用液相色谱、红外光谱、... 详细信息

试验旨在使用超声波辅助优化博落回根原阿片碱、别隐品碱的提取工艺。采用单因素试验筛选提取工艺中的时间、液料比、提取次数的最佳条件,通过正交试验确定最佳提取条件;采用硅胶层析纯化原阿片碱、别隐品碱,使用液相色谱、红外光谱、紫外光谱表征所得产物。结果显示,液料比30 mL/g、提取1次、提取时间为30 min时,原阿片碱、别隐品碱提取率最高,分别为92.64%、90.93%。表征结果显示,提取物经柱层析纯化所得物质确定为别隐品碱和原阿片碱。研究表明,试验所用方法简单、快速,可为博落回资源的利用提供参考。

关键词：博落回原阿片碱别隐品碱提取工艺超声波法

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原阿片碱对鸡卵巢组织的作用靶点分析

养禽与禽病防治 2023年第12期 2-11页

作者：孔研刘伟柳亦松湖南农业大学动物医学院长沙410128

本论文采用了网络药理学的方法,以原阿片碱(Protopine)为研究对象,探究其在鸡卵巢组织中的作用靶点。通过反向分子对接网站SwissTargetPrediction筛选原阿片碱对应的靶点,通过检索NCBI和GeneCards数据库收集与鸡卵巢组织炎症相关的靶点... 详细信息

本论文采用了网络药理学的方法,以原阿片碱(Protopine)为研究对象,探究其在鸡卵巢组织中的作用靶点。通过反向分子对接网站SwissTargetPrediction筛选原阿片碱对应的靶点,通过检索NCBI和GeneCards数据库收集与鸡卵巢组织炎症相关的靶点,进而得到原阿片碱治疗家禽卵巢炎症的关键靶点;将获得的关键靶点导入STRING数据库进行分析,并构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,通过Cytoscape软件可视化;通过STRING数据库对关键靶点进行基因本体(gene ontology,GO)功能及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析。共筛选得到原阿片碱的42个相关的靶点,与2489个鸡卵巢组织相关靶点取交集,获得17个交集靶点。PPI网络分析显示,MAPK8、CHEK1、PIK3CA、PTGS2、JAK1、JAK3、JAK2、PIK3CB、PIK3CD、CCNE1、CDK2、APP、TYMS和CYP19A1这些基因可能为原阿片碱治疗鸡卵巢炎症的关键靶点;KEGG通路富集分析得到炎症途径和凋亡相关途径信号通路。通过基因数据库的分析,预测出了可能与原阿片碱相关的基因、蛋白质、信号通路等,对于原阿片碱产品的临床的使用有较好的指导意义。

关键词：原阿片碱鸡卵巢网络药理学

原阿片碱改善脂多糖诱导肠上皮细胞凋亡、炎症和氧化应激反应的研究

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中国当代医药 2023年第36期30卷 5-10页

作者：徐忠军李君玉欧阳灿晖谢云叶艳清赣南医学院第一附属医院医学影像科江西赣州341000 赣南医学院第一附属医院消化科江西赣州341000

目的探讨原阿片碱对脂多糖(LPS)诱导的肠上皮细胞炎症、凋亡和氧化应激的影响。方法通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验筛选出5μg/ml的LPS处理NCM460细胞,同时加入不同浓度的原阿片碱(0、5、10、20μM)刺激细胞24 h。通过MTT法和流式细胞... 详细信息

目的探讨原阿片碱对脂多糖(LPS)诱导的肠上皮细胞炎症、凋亡和氧化应激的影响。方法通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验筛选出5μg/ml的LPS处理NCM460细胞,同时加入不同浓度的原阿片碱(0、5、10、20μM)刺激细胞24 h。通过MTT法和流式细胞术检测NCM460细胞活力和凋亡率。通过Western blot免疫印迹法检测各处理组中凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达水平。通过ELISA检测炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)的表达水平。通过ELISA检测抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)和髓过氧化物酶(MPO)的表达水平以及通过流式细胞术检测活性氧(ROS)表达水平,明确原阿片碱对NCM460细胞氧化应激反应的影响。结果 5μg/ml的LPS组的NCM460细胞活力低于阴性对照组,差异有统计学意义(P原阿片碱组NCM460细胞活力、Bcl-2蛋白高于LPS组,且呈剂量依赖性,差异有统计学意义(P原阿片碱组NCM460细胞的凋亡率、Bax蛋白、TNF-α、IL-1β和IL-6、氧化应激分子SOD、MDA、T-AOC、MPO和ROS的表达水平低于LPS组,且呈剂量依赖性,差异有统计学意义(P原阿片碱可通过降低细胞凋亡、炎症反应及氧化应激反应改善LPS诱导的肠上皮细胞炎性损伤。

关键词：原阿片碱脂多糖肠上皮细胞凋亡氧化应激炎症反应

原阿片碱通过线粒体凋亡途径抑制肝细胞癌生长

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药学学报 2021年第8期56卷 2223-2229页

作者：叶汉林乔淦王琳琳程丽林秀坤西南医科大学药学院四川泸州646000

全球范围内超过一半的肝癌病例发生在我国,亟待发现新的抗肝癌药物。已有报道表明,原阿片碱具有较好的抗肿瘤活性,但其作用机制尚不清楚。本研究采用CCK-8实验证实原阿片碱对肝癌细胞具有显著的抑制作用,流式细胞术和JC-1染色实验表明... 详细信息

全球范围内超过一半的肝癌病例发生在我国,亟待发现新的抗肝癌药物。已有报道表明,原阿片碱具有较好的抗肿瘤活性,但其作用机制尚不清楚。本研究采用CCK-8实验证实原阿片碱对肝癌细胞具有显著的抑制作用,流式细胞术和JC-1染色实验表明原阿片碱能够降低肝癌细胞线粒体膜电位、诱导肝癌凋亡,Western blot分析表明原阿片碱能够激活线粒体凋亡通路,上调Bax、细胞色素C(cytochrome C,Cyto-C)、剪切的半胱天冬氨酸蛋白酶-9(cleaved-caspase-9)、剪切的半胱天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved-caspase-3)、剪切的DNA修复酶(cleaved-poly ADPribose polymerase,cleaved-PARP)和凋亡酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)的表达,下调Bcl-2的表达。人肝癌裸鼠移植性肿瘤实验证实,50 mg·kg-1原阿片碱腹腔注射给药,抑瘤率可达到72.46%,并对小鼠体重没有明显影响。动物实验严格按照西南医科大学动物伦理委员会的规定执行。本研究提示,原阿片碱有潜力开发为治疗肝细胞癌的药物前体。

关键词：肝细胞癌原阿片碱抗肿瘤活性线粒体凋亡

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原阿片碱盐酸盐的结构研究

化学学报 1985年第3期43卷 310-312页

作者：罗士德龚运淮陈维新中国科学院昆明植物研究所

十员环异喹啉生物碱在植物中广为存在,是一类具有药物学意义的生物碱.一些研究表明,这类生物碱分子的十员环内氮原子和14-(或13-)位羰基碳原子之间有一种类酰胺的相互作用,具有成环的趋向;但对成环的条件及成环后的稳定性均未最终证明.... 详细信息

十员环异喹啉生物碱在植物中广为存在,是一类具有药物学意义的生物碱.一些研究表明,这类生物碱分子的十员环内氮原子和14-(或13-)位羰基碳原子之间有一种类酰胺的相互作用,具有成环的趋向;但对成环的条件及成环后的稳定性均未最终证明.我们对这类生物碱中的原阿片碱(protopine,1)及其盐酸盐的结构进行了研究,并通过 UV、IR、1CNMR 以及 X 衍射分析,证明1成盐后这种跨环相互作用已使氮原子和14-C 原子间形成稳定的单键,致使十员环变成两个六员环,整个分子变成了氢化原小蘖碱类生物碱基本骨架;当生物碱盐转为游离碱时,分子骨架又变回原来的构型.这种作用推测对十员环异喹啉生物碱具有普遍的意义.

关键词：原阿片碱氮原子基碳生物碱盐酸盐

基于药物转运体的元胡止痛方药效成分延胡索乙素、巴马汀、原阿片碱、欧前胡素和异欧前胡素跨血脑屏障机制研究

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药物评价研究 2023年第3期46卷 552-558页

作者：文蕊鑫王泽陈玥雯慈小燕董艳崔涛闫凤英伊秀林梁士民傅鹏武卫党安徽医科大学安徽合肥230032 天津药物研究院释药技术与药代国家重点实验室天津300301 中国医学科学院药物代谢新技术创新单元北京100730 天津和创生物技术有限公司天津300301 天津医科大学朱宪彝纪念医院、天津市内分泌研究所天津300134

目的基于药物转运体研究元胡止痛方药效成分延胡索乙素、巴马汀、原阿片碱、欧前胡素和异欧前胡素跨血脑屏障转运机制。方法建立hCMEC/D3-U87双层细胞模型研究延胡索乙素、巴马汀、原阿片碱、欧前胡素和异欧前胡素的跨血脑屏障吸收情况... 详细信息

目的基于药物转运体研究元胡止痛方药效成分延胡索乙素、巴马汀、原阿片碱、欧前胡素和异欧前胡素跨血脑屏障转运机制。方法建立hCMEC/D3-U87双层细胞模型研究延胡索乙素、巴马汀、原阿片碱、欧前胡素和异欧前胡素的跨血脑屏障吸收情况;通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法测定hCMEC/D3细胞中相关转运体蛋白多药耐药蛋白1(MDR1)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)、有机阳离子转运体1(OCT1)、OCT2、OCT3、有机阴离子转运体1(OCTN1)、OCTN2、OATP1A2、OATP2B1的mRNA表达水平;使用6株过表达人转运体的细胞株(S2-OCT1、S2-OCT3、S2-OCTN1、S2-OCTN2、HEK293-OATP1A2、HEK293-OATP2B1)进行摄取实验,判断各药物成分是否为转运体蛋白的底物。结果各成分均可以一定程度地跨越血脑屏障,延胡索乙素、欧前胡素、异欧前胡素具有更好的跨血脑屏障特性,巴马汀和原阿片碱的跨血脑屏障能力较弱。外排型转运蛋白MDR1、BCRP和摄入型转运蛋白OCTN1、OATP2B1、OATP1A2在hCMECD3细胞中有相对高的mRNA表达水平。延胡索乙素是OCT1、OCTN1和OATP1A2的底物;巴马汀是OCT1、OCT3、OCTN1、OCTN2和OATP2B1的底物;原阿片碱是OCT1、OCTN1和OCTN2的底物;欧前胡素、异欧前胡素是OCT3的底物。结论延胡索乙素可能通过转运体OATP1A2、OCT1、OCTN1跨越血脑屏障进入脑组织细胞;巴马汀可能通过OATP2B1、OCT1、OCT3、OCTN1、OCTN2传递进入脑组织细胞;原阿片碱可能通过OCT1、OCTN1和OCTN2传递进入脑组织细胞;欧前胡素、异欧前胡素可能通过OCT3传递进入脑组织细胞。

关键词：元胡止痛方血脑屏障药物转运体胡索乙素巴马汀原阿片碱欧前胡素异欧前胡素

原阿片碱对人肝星状细胞HSC-LX2增殖的抑制作用及机制研究

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中国药房 2019年第23期30卷 3210-3215页

作者：吴新玉李靖张金娟廖尚高梅青吴亚云席晓岚贵州医科大学药学院贵州贵安新区550025 国家苗药工程技术中心教育部民族药与中药开发应用工程研究中心贵阳550004 贵州医科大学基础医学院贵州贵安新区550025 贵州医科大学附属医院感染科贵阳550004

目的:考察原阿片碱对人肝星状细胞HSC-LX2增殖的抑制作用,并对其机制进行初步探讨。方法:采用MTT法测定25、50、100、200、400、500μmol/L原阿片碱作用24 h对HSC-LX2细胞增殖的影响,计算细胞增殖抑制率。另取HSC-LX2细胞分为对照组(含5... 详细信息

目的:考察原阿片碱对人肝星状细胞HSC-LX2增殖的抑制作用,并对其机制进行初步探讨。方法:采用MTT法测定25、50、100、200、400、500μmol/L原阿片碱作用24 h对HSC-LX2细胞增殖的影响,计算细胞增殖抑制率。另取HSC-LX2细胞分为对照组(含5%胎牛血清的1640培养基)和原阿片碱低、中、高浓度组(100、200、400μmol/L),作用24 h后,流式细胞术测定细胞凋亡率;荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法测定细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)mRNA的相对表达量,Western blot法测定细胞中α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、MMP-2蛋白的相对表达量。结果:25、50、100、200、400、500μmol/L原阿片碱对HSC-LX2细胞的增殖抑制率分别为0、6.9%、18.7%、34.2%、48.9%、53.9%。与对照组比较,原阿片碱低、中、高浓度组细胞中CollagenⅠ、TIMP-1 mRNA相对表达量和α-SMA蛋白相对表达量均显著降低,MMP-2蛋白相对表达量显著升高,差异均有统计学意义(P原阿片碱中、高浓度组细胞的凋亡率和MMP-2 mRNA相对表达量显著升高,α-SMA、CollagenⅢmRNA相对表达量和CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白相对表达量均显著降低,差异均有统计学意义(P原阿片碱可抑制HSC-LX2细胞增殖,诱导其凋亡,可降低α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、TIMP-1表达,升高MMP-2表达有关。

关键词：原阿片碱肝星状细胞HSC-LX2 增殖凋亡机制