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新孢子虫表面抗原P40基因的克隆及原核表达

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中国生物制品学杂志 2014年第6期27卷 789-792页

作者：杨滨僮赵权贺鹏飞常乐宫鹏涛李建华杨举李赫张国才张西臣吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130018 吉林大学动物医学学院吉林长春130062 内蒙古农业大学动物临床诊疗农业部重点实验室内蒙古呼和浩特010018

目的克隆并原核表达新孢子虫表面抗原P40基因。方法 PCR扩增新孢子虫表面抗原P40基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒pET-28a-P40,转化入大肠埃希菌Rosseta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物... 详细信息

目的克隆并原核表达新孢子虫表面抗原P40基因。方法 PCR扩增新孢子虫表面抗原P40基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒pET-28a-P40,转化入大肠埃希菌Rosseta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果重组原核表达质粒pET-28a-P40经PCR及双酶切鉴定构建正确;表达的重组P40蛋白相对分子质量约为40 000,有效识别鼠抗新孢子虫阳性血清。结论成功在Rosseta(DE3)中表达了新孢子虫表面抗原P40基因,为新孢子虫病疫苗的研制及血清学检测方法的建立奠定了基础。

关键词：新孢子虫 P40基因原核细胞基因表达

人源细胞色素P450 2E1与细胞色素P450氧化还原酶的共表达

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中国生物制品学杂志 2014年第4期27卷 498-502页

作者：徐彬彬张海风刘秀赵勤王俊平单杰郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室河南郑州450001

目的利用大肠埃希菌(E.coli)表达系统异源表达细胞色素P450 2E1(cytochrome P450 2E1,CYP2E1),并与细胞色素P450氧化还原酶(cytochrome P450 oxidoreductase,POR)实现共表达,使其具有代谢活性,为药物代谢的研究提供单一性的酶源。方法... 详细信息

目的利用大肠埃希菌(E.coli)表达系统异源表达细胞色素P450 2E1(cytochrome P450 2E1,CYP2E1),并与细胞色素P450氧化还原酶(cytochrome P450 oxidoreductase,POR)实现共表达,使其具有代谢活性,为药物代谢的研究提供单一性的酶源。方法以人肝组织RNA为模板,RT-PCR扩增CYP2E1基因,插入pCW空载体,构建重组表达质粒pCW-2E1,转化E.coli DH5α,IPTG诱导表达,表达产物经Western blot鉴定;利用双启动子原理构建CYP2E1与POR共表达的重组质粒pCW-2E1-POR,采用对氨基苯酚法检测CYP2E1重组酶的代谢活性,并对不同培养时间(18、28、38 h)的代谢活性进行比较。结果质粒pCW-2E1经PCR鉴定,证明构建正确;表达的重组人CYP2E1蛋白相对分子质量约56 000,主要以可溶性形式表达。质粒pCW-2E1-POR经PCR及酶切鉴定,证明构建正确;导入质粒pCW-2E1-POR的重组菌提取的蛋白样品具有明显的代谢活性,培养18、28、38 h后,代谢活性均值分别为(0.195±0.004)、(0.189±0.003)和(0.192±0.004)nmol/(min·mg),差异无统计学意义(P>0.05),但与导入质粒pCW-2E1的重组菌提取的蛋白样品的代谢活性相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了具有代谢活性的CYP2E1重组酶,且3个培养时间段之间的代谢活性无明显差异。

关键词：细胞色素P450 2E1 细胞色素P450氧化还原酶原核细胞基因表达代谢活性

伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的原核表达及其纯化

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中国生物制品学杂志 2014年第8期27卷 1002-1005页

作者：王艳凤白雪刘晓雷王楠丁静刘明远吉林大学人兽共患病研究所吉林长春130062

目的原核表达并纯化伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(Trichinella pseudospiralis serine protease inhibitor,Tpserpin)基因,并鉴定其抗原性。方法从伪旋毛虫肌幼虫提取总RNA,RT-PCR扩增Tp-serpin基因,插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-Tp-serpin,转化大肠埃希菌(E.coli)Rosetta gami(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析后,用Ni-NTA Agarose亲和层析纯化,纯化产物经SDS-PAGE分析纯度,Western blot鉴定反应原性。结果重组表达质粒pET-28a-Tp-serpin经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确,与GenBank中登录的Tp-serpin基因相似性达99%。表达的重组Tp-serpin蛋白相对分子量约43 000,表达量约占菌体总蛋白的40%,主要以可溶性形式存在;纯化后的重组Tp-serpin蛋白纯度达95%以上,可被伪旋毛虫感染60 d的猪血清特异性识别,具有较好的反应原性。结论成功构建了重组表达质粒pET-28a-Tp-serpin,并在E.coli Rosetta gami(DE3)中表达了重组蛋白,为旋毛虫病的血清学诊断候选抗原的研制及开发提供了科学依据,也为阐明serpin在伪旋毛虫入侵时期调节宿主免疫反应的作用奠定了基础。

关键词：伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂原核细胞基因表达纯化

边缘无浆体MSP1α与MSP1β基因的克隆表达及其对牛红细胞的黏附特性

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中国生物制品学杂志 2013年第9期26卷 1242-1246,1250页

作者：倪宏波钱爱东姜海芳黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 吉林农业大学动物科技学院吉林长春130118

目的原核表达边缘无浆体(Anaplasma marginale,A.marginale)MSP1α和MSP1β蛋白,并检测其对牛红细胞的黏附作用。方法通过PCR法扩增MSP1α和MSP1β基因,插入表达载体pGEX-6p-1中,转化感受态大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组MSP1α和MSP1β蛋白经透析法纯化后,分别免疫新西兰白兔和商品蛋鸡,制备免疫兔血清及抗MSP1α和MSP1βIgY抗体,Western blot法分析其免疫原性,间接免疫荧光法(immunofluorescence assay,IFA)检测其在大肠埃希菌外膜上的表达,血凝试验(hemagglutination test,HA)和血凝抑制试验(hemagglutination inhibition test,HI)检测其对牛红细胞的黏附作用。结果重组表达质粒pGEX-6p-1-MSP1α和pGEX-6p-1-MSP1β经PCR、双酶切及测序证实构建正确;表达的重组MSP1α和MSP1β蛋白相对分子质量分别约为58 000和107 000,主要以包涵体形式存在,表达量分别占菌体总蛋白的31%和14%;纯化的重组MSP1α和MSP1β蛋白纯度分别可达93%和91%,可与免疫兔血清发生反应;抗MSP1α和MSP1βIgY抗体可分别与表达MSP1α和MSP1β蛋白的重组菌发生反应;重组MSP1α和MSP1β蛋白对牛红细胞具有明显的黏附作用,吸附率可达56.4%和52.7%。结论MSP1α和MSP1β基因可在大肠埃希菌外膜上大量表达,并对牛红细胞具有明显的吸附作用,为进一步揭示牛边缘无浆体病的作用机理奠定了基础。

关键词：边缘无浆体 MSP1α蛋白 MSP1β蛋白原核细胞基因表达黏附

狂犬病病毒CTN-1株G蛋白的原核表达及基本功能评价

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中国生物制品学杂志 2016年第10期29卷 1032-1036页

作者：巩蔚严丽蔚朱文兵张雪梅徐婧雯吴忠香卢孔杰孙明董少忠中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的原核表达狂犬病病毒(rabies virus,RV)CTN-1株G蛋白,并评价其基本功能。方法采用RT-PCR法扩增RV CTN-1株G蛋白基因,插入原核表达载体p GEX-5X-1,构建重组表达质粒p GEX-5X-1-CTN,转化入Rosetta(DE3)p Lys S,IPTG诱导表达。表达的重... 详细信息

目的原核表达狂犬病病毒(rabies virus,RV)CTN-1株G蛋白,并评价其基本功能。方法采用RT-PCR法扩增RV CTN-1株G蛋白基因,插入原核表达载体p GEX-5X-1,构建重组表达质粒p GEX-5X-1-CTN,转化入Rosetta(DE3)p Lys S,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经亲和层析纯化后,采用间接ELISA法检测其与阳性血清的结合性能及亲和力。结果重组表达质粒经双酶切及测序证实构建正确;纯化的重组蛋白RV-G相对分子质量约85 000,纯度可达85%,能与阳性血清特异性结合,且具有较好的区分性,与阳性血清的亲和力常数为1.2×1010 M-1。结论成功原核表达、纯化获得了纯度较高、特异性较好、亲和力较强、灵敏度较高的RV CTN-1株G蛋白,为研究G蛋白的抗原表位、建立针对RV G蛋白的ELISA抗体检测方法及其中和抗体的分选检测奠定了基础。

关键词：狂犬病病毒 CTN-1株 G蛋白原核细胞基因表达亲和力酶联免疫吸附测定

牛轮状病毒VP6蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

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中国生物制品学杂志 2016年第7期29卷 696-700页

作者：冉旭华曹思刘阳阳张玲玲张峣倪宏波闻晓波黑龙江八一农垦大学预防兽医学省重点实验室黑龙江大庆163319

目的原核表达牛轮状病毒(rotavirus,RV)VP6蛋白,并制备其多克隆抗体。方法根据Gen Bank中登录的牛RV UK株VP6基因序列(X53667.1)设计一对特异性引物,RT-PCR扩增牛RV UK株VP6全长编码区片段,克隆至载体p ET-28a,构建重组表达质粒p ET-28a... 详细信息

目的原核表达牛轮状病毒(rotavirus,RV)VP6蛋白,并制备其多克隆抗体。方法根据Gen Bank中登录的牛RV UK株VP6基因序列(X53667.1)设计一对特异性引物,RT-PCR扩增牛RV UK株VP6全长编码区片段,克隆至载体p ET-28a,构建重组表达质粒p ET-28a-Bo-RV-VP6,转染至E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析。将重组蛋白与弗氏佐剂混合后免疫豚鼠,共免疫3次,每次间隔2周,末次免疫后2周,经心脏采血,分离血清,制备VP6多克隆抗体,Western blot法检测其与牛RV的反应原性。结果经双酶切和测序鉴定,重组表达质粒p ET-28a-Bo-RV-VP6构建正确。重组蛋白以包涵体的形式表达,表达产物分别为43 000、34 000、27 000和15 000 4种不同相对分子质量的重组蛋白,纯化后纯度可达95%以上,可与牛RV阳性血清发生特异性反应。制备的VP6蛋白多克隆抗体效价>1∶7 000,且可识别RV天然VP6蛋白。结论原核表达了牛RV VP6蛋白,并制备了抗VP6多克隆抗体,为后续RV疫苗效力评价及RV侵入机理等方面的研究奠定了基础。

关键词：牛轮状病毒 VP6基因原核细胞基因表达多克隆抗体

呼吸道合胞病毒表位重组蛋白F1-F/M2的原核表达、纯化及其免疫原性

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中国生物制品学杂志 2014年第9期27卷 1118-1123页

作者：胡兵方志正湖北省疾病预防控制中心传染病防治研究所湖北武汉430079 武汉生物制品研究所有限责任公司湖北武汉430060

目的原核表达、纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)表位重组蛋白F1-F/M2,并检测其在小鼠体内的免疫原性,为RSV亚单位疫苗的研制、疫苗所致免疫病理反应机理的研究提供参考。方法利用定点突变技术对原核表达载体pGEX-6... 详细信息

目的原核表达、纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)表位重组蛋白F1-F/M2,并检测其在小鼠体内的免疫原性,为RSV亚单位疫苗的研制、疫苗所致免疫病理反应机理的研究提供参考。方法利用定点突变技术对原核表达载体pGEX-6p-1进行改造,在其GST标签前制造一个HindⅢ酶切位点;从RSV long株中扩增F1片段,从质粒pET28a-G1-F/M2中扩增F/M2基因片段,并在克隆载体pUC19的辅助下,将F1-F/M2基因连接至改造后的pGEX-6p-1载体中,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-F1-F/M2,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经6×His-tag标签蛋白纯化试剂盒纯化后,经尿素浓度梯度透析复性,SDS-PAGE分析其纯度,BCA法检测其浓度,Western blot法分析其反应原性。将纯化的重组蛋白F1-F/M2经铝佐剂乳化后,经腹腔免疫BALB/c小鼠,共3次,间隔10 d,末次免疫后10 d,采用空斑减少试验检测小鼠血清、肺组织匀浆和鼻腔冲洗液中抗RSV中和抗体水平;取小鼠脾脏,分离脾单个淋巴细胞,采用ELISAPOT技术检测重组蛋白诱导产生IFNγ的细胞免疫水平。结果重组表达质粒pGEX-6p-1-F1-F/M2经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白F1-F/M2相对分子质量约为20 800,表达量约占菌体总蛋白的20%,几乎全部以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白的纯度约为90%,浓度为0.42 mg/ml,可与小鼠抗RSV血清发生特异性反应;重组蛋白F1-F/M2能诱导小鼠血清中产生较高滴度的中和抗体(1∶289),肺部组织匀浆中略弱(1∶242),鼻腔冲洗液中未检测到中和抗体;重组蛋白F1-F/M2免疫小鼠的脾淋巴细胞经体外抗原刺激能产生特异性IFNγ斑点。结论成功原核表达了表位重组蛋白F1-F/M2,纯化后的重组蛋白能诱导产生较高滴度的中和抗体及CTL应答,有望开发成RSV亚单位疫苗。

关键词：呼吸道合胞病毒表位重组蛋白原核细胞基因表达纯化免疫原性

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羊布氏菌外膜蛋白10基因的原核表达

中国生物制品学杂志 2012年第1期25卷 39-42页

作者：李晓艳王景龙卜昭阳张瑞王兴龙军事医学科学院军事兽医研究所长春130122 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室长春130122

目的原核表达并纯化羊布氏菌外膜蛋白10(Outer membrane protein,Omp10)。方法利用PCR技术扩增羊布氏菌16M株Omp10基因,插入原核表达载体pET-28a(+),构建重组原核表达质粒pET-28a-Omp10,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组O... 详细信息

目的原核表达并纯化羊布氏菌外膜蛋白10(Outer membrane protein,Omp10)。方法利用PCR技术扩增羊布氏菌16M株Omp10基因,插入原核表达载体pET-28a(+),构建重组原核表达质粒pET-28a-Omp10,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组Omp10经HisTrapTMFF纯化后,Western blot分析表达产物的反应原性。结果重组原核表达质粒pET-28a-Omp10经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组Omp10相对分子质量约15 000,能被羊布氏菌阳性血清所识别。结论已成功在大肠杆菌中表达了羊布氏菌Omp10,为羊布氏菌病血清学诊断方法的建立提供了材料。

关键词：羊布氏菌细菌外膜蛋白质类原核细胞基因表达诊断鉴别

肠道病毒71型3C基因原核表达质粒的构建表达及纯化

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中国生物制品学杂志 2012年第12期25卷 1615-1617页

作者：江月丛浩龙李梨重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室重庆400016

目的构建肠道病毒71型(Entervirus71,EV71)3C基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中进行表达并纯化。方法以病毒的反转录产物为模板,PCR扩增EV71 3C基因,克隆至pGEx-4T-1载体中,构建重组表达质粒pGEx-3C,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表... 详细信息

目的构建肠道病毒71型(Entervirus71,EV71)3C基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中进行表达并纯化。方法以病毒的反转录产物为模板,PCR扩增EV71 3C基因,克隆至pGEx-4T-1载体中,构建重组表达质粒pGEx-3C,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达的重组融合蛋白GSR-3C经GST-Agarose亲和层析和分子筛层析纯化后,Western blot检测其反应原性。结果重组表达质粒pGEx-3C经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约46 000,表达量约占菌体总蛋白的50%,主要以可溶性形式表达;纯化后的重组融合蛋白纯度大于90%,可与小鼠抗EV71单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了重组表达质粒pGEx-3C,在大肠杆菌中高效分泌表达并纯化了重组GST-3C融合蛋白,为EV713C蛋白酶结构与功能的研究及3C靶向药物和疫苗的研究奠定了基础。

关键词：肠道病毒A型,人 3C蛋白原核细胞基因表达纯化