伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的原核表达及其纯化

作     者：王艳凤 白雪 刘晓雷 王楠 丁静 刘明远 WANG Yan-feng;BAI Xue;LIU Xiao-lei;WANG Nan;DING Jing;LIU Ming-yuan

作者机构：吉林大学人兽共患病研究所吉林长春130062 

出 版 物：《中国生物制品学杂志》 (Chinese Journal of Biologicals)

年 卷 期：2014年第27卷第8期

页      面：1002-1005页

学科分类：0710[理学-生物学] 0831[工学-生物医学工程（可授工学、理学、医学学位）] 1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 100103[医学-病原生物学] 0703[理学-化学] 0836[工学-生物工程] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(NSFC81201302) 

主　　题：伪旋毛虫 丝氨酸蛋白酶抑制剂 原核细胞 基因表达 纯化 

摘      要：目的原核表达并纯化伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(Trichinella pseudospiralis serine protease inhibitor,Tpserpin)基因,并鉴定其抗原性。方法从伪旋毛虫肌幼虫提取总RNA,RT-PCR扩增Tp-serpin基因,插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-Tp-serpin,转化大肠埃希菌(E.coli)Rosetta gami(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析后,用Ni-NTA Agarose亲和层析纯化,纯化产物经SDS-PAGE分析纯度,Western blot鉴定反应原性。结果重组表达质粒pET-28a-Tp-serpin经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确,与GenBank中登录的Tp-serpin基因相似性达99%。表达的重组Tp-serpin蛋白相对分子量约43 000,表达量约占菌体总蛋白的40%,主要以可溶性形式存在;纯化后的重组Tp-serpin蛋白纯度达95%以上,可被伪旋毛虫感染60 d的猪血清特异性识别,具有较好的反应原性。结论成功构建了重组表达质粒pET-28a-Tp-serpin,并在E.coli Rosetta gami(DE3)中表达了重组蛋白,为旋毛虫病的血清学诊断候选抗原的研制及开发提供了科学依据,也为阐明serpin在伪旋毛虫入侵时期调节宿主免疫反应的作用奠定了基础。