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SCN1A内含子突变对Nav1.1蛋白表达的影响及与癫痫表型的相关性研究

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SCN1A内含子突变对Nav1.1蛋白表达的影响及与癫痫表型的相关性研究

作者：周喜靖广西医科大学

学位级别：硕士

背景:SCN1A基因编码I型电压依赖型钠通道(Na1.1)a1亚基,在中枢神经系统广泛表达,其是多种癫痫综合征与特发性癫痫,尤其是热性惊厥相关癫痫(epilepsy associated with febrial seizures,EFS+)主要的致病基因和重要的候选基因。SCN1A相关E... 详细信息

背景:SCN1A基因编码I型电压依赖型钠通道(Na1.1)a1亚基,在中枢神经系统广泛表达,其是多种癫痫综合征与特发性癫痫,尤其是热性惊厥相关癫痫(epilepsy associated with febrial seizures,EFS+)主要的致病基因和重要的候选基因。SCN1A相关EFS+临床表型复杂,涵盖了如GEFS+(Genetic epilepsy with febrile seizures plus),FEFS+(Focal epilepsy with febrile seizures),Dravet综合征(Dravet syndrome,DS)等一系列严重程度不一的表型。内含子处于基因非编码区,功能复杂,所涉及的基因剪切机制目前尚未完全清楚。前期研究在EFS+表型FEFS+和DS中发现5个SCN1A内含子不同区域的突变,经Minigene体外剪切实验,明确这些突变均可造成m RNA剪切的异常,从而表现为SCN1A的截短突变,并有可能导致Na1.1蛋白的截短。但其最终的Na1.1蛋白表达情况及差异,以及其与表型的相关性尚不清楚。目的:在前期SCN1A内含子突变的基因表达研究基础上,通过构建SCN1A截短突变重组质粒,经HEK-293T细胞体外表达,检测SCN1A内含子不同区域突变后相应截短蛋白表达情况及其差异,以探究其可能的致病机制及与EFS+临床表型轻重之间的相关性。方法:纳入前期研究已证实的5个EFS+相关的SCN1A内含子不同区域的突变(固有剪切位点突变c.602+1G>A、c.4853-1G>C;可变剪切位点突变c.473+5G>A,c.473+5G>C;深部内含子突变c.4853-25T>A)所致4个截短突变,以野生型质粒p CMV-EYFP-SCN1A-WT为模板,通过定点诱变,构建伴有融合表达EYFP的截短突变重组质粒(p CMV-EYFP-Mu SCN1A);通过细胞转染,将重组质粒于HEK293-T细胞体外表达后提取总蛋白(Input)与表面蛋白(Surface),应用western-bloting(WB)技术对Na1.1蛋白在细胞的表达进行定性和定量分析;进一步通过激光共聚焦检测荧光技术,观察和分析Na1.1蛋白的亚细胞分布情况并进行荧光定量分析。结果:1、经测序验证,成功构建了4个SCN1A内含子突变相关截短突变质粒:c.602+1G>A对应突变体p CMV-EYFP-602,c.4853-1G>C对应突变体p CMV-EYFP-4853-1;c.473+5G>A和c.473+5G>C对应突变体p CMV-EYFP-473;c.4853-25T>A对应突变体p CMV-EYFP-4853-25。2、WB结果显示,与固有剪切位点并DS相关的SCN1A突变体所致的Na1.1截短蛋白p.T160-V203del和p.G1618-I1625del可在细胞膜上表达(分子量分别为223.8KD和228.1KD),表达量较野生型明显增多(前者p突变体所致的Na1.1截短蛋白p.V126fs X135(预测分子量15.3KD)未见有细胞膜的表达,而另一与深部内含子区并FEFS+相关的SCN1A突变体所致的Na1.1截短蛋白p.G1618Vfs X1625(分子量185.5KD)在细胞膜表达的水平较野生型明显减少(p突变体截短蛋白的细胞膜表达水平明显少于DS相关突变体(p突变体的细胞膜荧光表达水平明显低于DS相关突变体(P内含子区等SCN1A基因内含子不同区域的突变均可能导致Na1.1蛋白发生异常截短;2、SCN1A基因内含子区不同区域突变所致截短蛋白在细胞膜上可有不同程度的表达,其表达差异与癫痫表型的严重程度存在相关性。

关键词： SCN1A基因内含子突变 EFS+ 膜蛋白亚细胞定位

DMD基因内含子突变致Becker型肌营养不良1例报告并文献复习

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临床医学进展 2023年第8期13卷 12838-12844页

作者：陈宇尹训章高鑫柏翠邵乐平林毅青岛大学附属医院儿科山东青岛青岛大学青岛医学院山东青岛青岛市立医院肾脏科山东青岛

目的:探讨DMD基因内含子突变所致Becker型肌营养不良(BMD)的临床表现及基因变异特征。方法:回顾分析1例确诊BMD患儿的临床资料、肌肉病理及基因检测结果并复习相关文献。结果:患儿,男,12岁,2年前活动后出现乏力伴双下肢不适感,小便如茶... 详细信息

目的:探讨DMD基因内含子突变所致Becker型肌营养不良(BMD)的临床表现及基因变异特征。方法:回顾分析1例确诊BMD患儿的临床资料、肌肉病理及基因检测结果并复习相关文献。结果:患儿,男,12岁,2年前活动后出现乏力伴双下肢不适感,小便如茶色,急性期肌酸激酶、肌红蛋白水平可升高至正常值100倍以上;尿液分析示隐血3+,红细胞计数正常;代谢缺陷筛查(血、尿有机酸分析)无异常。后患儿乏力及尿液异常反复发生,全外显子检测无DMD基因相关突变;肌肉病理示骨骼肌呈肌病样改变,Dystrophin表达下降;DMD基因mRNA测序示存在异常剪接。患儿最终确诊为BMD。结论:反复横纹肌溶解的患者亦应考虑BMD的可能;对DMD基因外显子检测无异常,但Dystrophin表达异常的患者,需警惕内含子突变所致基因异常剪接。

关键词： Becker型肌营养不良横纹肌溶解 DMD基因内含子突变 mRNA

WASP基因第七内含子突变致Wiskott-Aldrich综合征1例

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广东医学 2017年第11期38卷 1786-1786页

作者：彭昌杨昌键幸黔鲁遵义医学院附属医院儿内一科贵州遵义563000

患儿，男，6个月，因“腹泻伴发热3d”于2016年4月4日收入院。该患儿新生儿时因“新生儿肺炎”人住我院新生儿科，查血小板52×10^9·L-1，白细胞及血红蛋白正常，伴有面部湿疹，考虑为感染所致血小板降低，当时未检测免疫功能及基因筛... 详细信息

患儿，男，6个月，因“腹泻伴发热3d”于2016年4月4日收入院。该患儿新生儿时因“新生儿肺炎”人住我院新生儿科，查血小板52×10^9·L-1，白细胞及血红蛋白正常，伴有面部湿疹，考虑为感染所致血小板降低，当时未检测免疫功能及基因筛查，经积极抗炎、对症支持治疗后好转出院。后患儿仍反复出现呼吸系统感染，于当地社区卫生院治疗后好转，而面部及躯干部湿疹经治疗后仍反复发作，但全身皮肤黏膜及腔道均未见出血表现。

关键词：内含子突变 ASP基因 h综合征对症支持治疗呼吸系统感染血小板降低面部湿疹新生儿科

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脂蛋白脂肪酶内含子3C→T突变

中国动脉硬化杂志 2003年第6期11卷 570-572页

作者：杨宇虹葛林赵郁解用虹天津医科大学生物化学教研室天津市300070

为筛查中国人群脂蛋白脂肪酶基因的突变情况 ,并探讨这些突变对脂蛋白代谢可能产生的影响 ,研究者利用聚合酶链反应—单链构象多态性分析技术 ,对 14 0例人群 (高甘油三酯血症组 5 1例 ,正常对照组 89例 )的脂蛋白脂肪酶基因进行了突变... 详细信息

为筛查中国人群脂蛋白脂肪酶基因的突变情况 ,并探讨这些突变对脂蛋白代谢可能产生的影响 ,研究者利用聚合酶链反应—单链构象多态性分析技术 ,对 14 0例人群 (高甘油三酯血症组 5 1例 ,正常对照组 89例 )的脂蛋白脂肪酶基因进行了突变筛查 ,对可疑突变的扩增样品进行DNA序列测定。结果在外显子 4扩增片段 (包括内含子—外显子交界区 )有 2例可疑突变被检出 ,经测序证实均为内含子 3受位剪接位点上游 6bp的C→T转换突变杂合子。由于该突变仅见于重度高甘油三酯血症患者 ,结合国内外相关文献 ,研究者认为我国人群存在脂蛋白脂肪酶基因内含子 3受位剪接位点的C→T突变 ,该突变可能是我国人群高甘油三酯血症的遗传易患因子。

关键词：脂蛋白脂肪酶聚合酶链反应-单链构象多态性分析高甘油三酯血症内含子突变

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颅内海绵状血管畸形CCM1基因突变的分析

中华医学杂志 2005年第32期85卷 2254-2258页

作者：谢嵘陈衔城樊永峰夏鹰高亮李晓牧复旦大学附属华山医院神经外科上海200040 复旦大学附属华山医院神经病学研究所上海200040 复旦大学附属中山医院内分泌科

目的探讨颅内海绵状血管畸形(ICM)患者CCM1基因突变的情况。方法收集经手术病理证实的ICM患者25例,均为汉族,其中家族性ICM7例。以30例正常健康人作为对照组。抽取两组对象的静脉血,提取基因组DNA、PCR,扩增CCM1基因8、9、11、12、13、1... 详细信息

目的探讨颅内海绵状血管畸形(ICM)患者CCM1基因突变的情况。方法收集经手术病理证实的ICM患者25例,均为汉族,其中家族性ICM7例。以30例正常健康人作为对照组。抽取两组对象的静脉血,提取基因组DNA、PCR,扩增CCM1基因8、9、11、12、13、15、16、17、18号外显子及部分两侧相邻的内含子、DNA测序,结果与GenBank比较。结果ICM患者中有11例被检测出7个新的CCM1基因突变,突变率为44%(11/25)。其中错义突变3个:12号外显子,1160A→C(Q387P)、1172C→T(S391F);13号外显子,1405A→C(N469H),插入突变2个:8号外显子,704insT(K246stop);18号外显子,2138insG(T733stop),内含子突变1个:IVS124C→T,同义突变1个:17号外显子,1875C→T(F625F)。除了1875C→T的同义突变可能为基因多态性以外,其他被发现的CCM1基因突变均导致编码KRIT蛋白的变化。对照组的CCM1基因未检测出异常。家族性ICM的CCM1基因突变率高于散发性ICM,两者比较差异有统计学意义(P突变,导致编码的KRIT1蛋白功能改变或缺失,这与ICM发病相关,是ICM发病的遗传学基础。

关键词：中枢系统血管畸形基因突变海绵状血管畸形基因突变率颅内 CCM1基因内含子突变基因组DNA ICM

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O新等位基因与B抗原弱表达的研究

中国输血杂志 2017年第10期30卷 1149-1152页

作者：王天菊左琴琴齐珺吴大洲王满妮褚晓月张薇薇王红徐华陕西省血液中心陕西西安710061

目的对检测中遇到的1例ABO正反定型不符的献血者标本进行血清学和分子生物学鉴定并对其机制进行分析。方法常规血清学检测;PCR扩增直接测序和克隆测序分析其单体型。结果血清学结果为B弱;直接测序和克隆测序结果为O01/O05,O01 IVS6-25 ... 详细信息

目的对检测中遇到的1例ABO正反定型不符的献血者标本进行血清学和分子生物学鉴定并对其机制进行分析。方法常规血清学检测;PCR扩增直接测序和克隆测序分析其单体型。结果血清学结果为B弱;直接测序和克隆测序结果为O01/O05,O01 IVS6-25 A>G突变。结论第一次证实了O等位基因血清学可以表现为B型,对其机制仍需深入研究。

关键词： ABO血型 ABO基因分型正反定型不符内含子突变

Si-1基因在肿瘤中的缺失和突变状况初步研究

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云南大学学报（自然科学版） 2003年第3期25卷 277-282页

作者：谭德勇杨克赖建华余敏杨海霞唐伟云南大学生命科学院生物化学实验室云南昆明650091

通过对Si-1基因6,14和15号外显子区段的PCR扩增,分析了Si-1基因在116例恶性肿瘤组织、1例良性肿瘤和21例非肿瘤组织的缺失和突变.发现恶性肿瘤中有7例缺失,8例有内含子突变;良性肿瘤中没有缺失和突变;非肿瘤组织中没有缺失,1例有内含子... 详细信息

通过对Si-1基因6,14和15号外显子区段的PCR扩增,分析了Si-1基因在116例恶性肿瘤组织、1例良性肿瘤和21例非肿瘤组织的缺失和突变.发现恶性肿瘤中有7例缺失,8例有内含子突变;良性肿瘤中没有缺失和突变;非肿瘤组织中没有缺失,1例有内含子突变.脑肿瘤的缺失率最高,达到57.1%,内含子突变率42.9%;肝癌的缺失率达15%,内含子突变率26.7%.上述结果表明,Si-1基因在脑肿瘤和肝癌组织中有较高的缺失和内含子突变,显示该基因有可能是这2种肿瘤的易感基因.

关键词： Si-1基因肿瘤缺失率突变状况恶性肿瘤内含子突变易感基因基因变异等位基因丢失

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单核苷酸突变致病性预测算法研究

单核苷酸突变致病性预测算法研究

作者：高晓峰哈尔滨工业大学

学位级别：硕士

生物信息技术的飞速发展使得各类生命活动被不断深入研究,新一代高通量测序为科研人员提供了海量的遗传数据,这对医疗、农业、环境保护等领域的发展产生了巨大的推动作用。当前新冠肺炎(COVID-19)在全球肆虐,严重威胁着世界人民的生命健... 详细信息

生物信息技术的飞速发展使得各类生命活动被不断深入研究,新一代高通量测序为科研人员提供了海量的遗传数据,这对医疗、农业、环境保护等领域的发展产生了巨大的推动作用。当前新冠肺炎(COVID-19)在全球肆虐,严重威胁着世界人民的生命健康,在这样的情况下,如何利用已有的大量数据来预防和治理各类相关的问题已经成为了当下讨论的主流,越来越多研究人员的加入使得一些原有问题得到了很好地解决,但是仍旧存在诸多难题困扰学术界。当前,评估编码区和非编码区单核苷酸突变(SNV)的功能影响仍是生物信息领域的巨大挑战之一。过去,已经开发了很多算法来评估与疾病相关的SNV造成的影响,其中,许多算法是针对编码区的突变进行致病性预测。还有一些例如CADD的算法可以对任意SNV致病性进行预测,这类算法对不同类型突变预测效果存在差异,在针对错义突变时性能较差。针对此问题,本文提出了基于注意力机制的神经网络算法NNP(Neural Network Predictor with multiple features)来进行致病性预测。本文首先分析了现有致病性预测算法的原理和它们存在的问题,在统计了突变的类型占比后,确定算法输入数据需要包含内含子突变和错义突变的特征。为了兼顾可解释性和神经网络的预测性能,确定了使用带注意力机制的神经网络模型。接下来本文通过实验验证了使用内含子突变和错义突变特征的合理性,使用随机森林等多种传统的分类模型进行实验,证明了带注意力机制的神经网络模型的预测性能更强。随后使用各种单核苷酸突变致病性预测算法进行实验对比,实验结果表明NNP的性能较CADD、DANN、Ph D-SNPg这些通用致病性预测算法有提升,尤其是在错义突变的致病性预测方面有较大进步,并通过使用先天性心脏病和自闭症谱系疾病患者的突变数据证明了NNP算法具有较强的泛化性和鲁棒性,说明这是一种具有实际价值的算法。最后,本文对所使用的Clinvar、1000 Genomes、疾病患者的数据进行了整理,基于实验使用的致病性预测算法和本文提出的NNP算法设计开发了SNV致病性预测可视化系统,以帮助相关领域的科研人员进行有效的突变致病性注释,减少研究人员因复现原有算法所需的人力和时间成本,加速该领域的研究进展。

关键词：单核苷酸突变致病性预测错义突变内含子突变注意力机制

我国慢性胰腺炎主要致病基因的突变分布及其临床意义

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我国慢性胰腺炎主要致病基因的突变分布及其临床意义

作者：唐欣颖中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

第一部分:我国慢性胰腺炎主要致病基因型及其对临床病程的影响研究背景和目的慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)是多种因素引起的胰腺的慢性纤维炎症性疾病,可导致不可逆的形态变化和内外分泌功能的进行性损伤。CP的病程迁延、预后不... 详细信息

第一部分:我国慢性胰腺炎主要致病基因型及其对临床病程的影响研究背景和目的慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)是多种因素引起的胰腺的慢性纤维炎症性疾病,可导致不可逆的形态变化和内外分泌功能的进行性损伤。CP的病程迁延、预后不良,患者的生活质量极差,严重的甚至发生胰腺癌。但由于CP病因机制不清,故目前尚缺乏根治方法。随着遗传学研究的进展,人们越来越认识到遗传学因素在CP发生、发展及临床结果等方面的重要作用。迄今为止,遗传学家们已经基本确认了SPINK1、PRSS1、CTRC和CFTR四个基因是CP的主要易感基因。然而,其致病突变对疾病发病年龄和临床结果的潜在影响,以及它们与环境危险因素的潜在相互作用仍不清楚。多项研究发现中西方CP人群存在显著遗传学差异,欧美的研究结果不能完全代表中国CP人群的数据。因此,开展中国CP人群大规模的易感基因的二代靶向测序,探索基因型-表型的关联至关重要。测序结果显示,我国超过半数的CP突变阳性患者携带SPINK1致病基因型,而其中最具常见的是SPINK1 c.194+2T>C突变。这与西方报道的研究结果存在很大差异。因此,本研究进一步对SPINK1 c.194+2T>C突变与CP的相关性进行Meta分析,探究其在CP不同种族和病因中的作用差异。本研究的目的是建立中国人群大型CP队列,筛查SPINK1、PRSS1、CTRC和CFTR基因中的罕见致病突变,并探讨其与发生CP风险的相关性。同时,对SPINK1c.194+2T>C突变与CP的相关性进行Meta分析。研究方法对1061名汉族CP患者和1196名对照的4个CP相关基因的目标区域进行了靶向测序,并用Sanger测序进行验证。为了评估基因-环境相互作用,将患者分为三个亚组:特发性CP(idiopathic CP,ICP),酒精性CP(alcoholic CP,ACP)和吸烟相关CP(smoking-associated CP,SCP)。使用Kaplan-Meier模型评估罕见致病突变对CP发病年龄和临床结果的潜在影响。使用Pub Med和EMBASE数据库,对2000年1月至2018年1月期间发表的有关SPINK1 c.194+2T>C突变与CP相关性的文献进行系统评价和Meta分析,并按种族和病因分类后进行亚组分析。研究结果1、在535名(50.42%)CP患者中发现了涉及SPINK1、PRSS1、CTRC和CFTR基因的罕见致病基因型,但在对照中仅有71名(5.94%)(OR=16.12;P突变,中度为SPINK1基因c.194+2T>C杂合突变,重度为PRSS1基因p.R122H和SPINK1基因c.194+2T>C纯合突变。5、Meta分析结果显示SPINK1 c.194+2T>C与东亚ICP密切相关。结论1、SPINK1、PRSS1、CTRC和CFTR基因中的罕见致病基因型显著影响CP的发病年龄和临床结果。2、CP中存在广泛的基因-环境相互作用,首次将吸烟相关CP作为独立亚组进行分析。3、SPINK1 c.194+2T>C突变应作为我国CP最重要的筛查位点。第二部分:我国慢性胰腺炎主要致病基因SPINK1内含子突变的筛选及其功能分析研究背景和目的随着高通量测序等研究的广泛开展,慢性胰腺炎相关已知基因突变分布和临床意义越来越清晰。然而,在中国人群中依然有将近半数的CP患者无法找到致病突变。除了探索新基因,研究者们对已知基因的内含子区域开展了进一步的研究。SPINK1基因由于在CP患者中突变频率最高,因此受到关注。越来越多的SPINK1深度内含子区域的突变,随着高通量测序的应用而被鉴定出来。中国CP人群还缺乏大规模筛查SPINK1内含子突变的研究。尽管SPINK1基因中大部分经典剪接位点突变、无义突变或大片段基因组缺失的功能意义已研究清楚,但还有很多新发现的启动子和增强子突变、错义突变或与经典剪接位点同时发生的内含子突变的功能尚不明确。目前,已有多种方法应用于对SPINK1内含子突变在CP中的临床意义研究,包括软件剪接预测和体外的剪接功能分析实验。研究表明功能实验和软件剪接预测结果之间密切关联。据此,本研究设计了一套专

关键词：慢性胰腺炎易感基因临床表型基因-环境相互作用荟萃分析内含子突变异常剪接软件预测功能分析诊断流程