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黄色粘球菌中四型菌毛蛋白与胞外多糖特异性结合关键位点的研究

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黄色粘球菌中四型菌毛蛋白与胞外多糖特异性结合关键位点的研究

作者：张坤梅山东大学

学位级别：硕士

作为粘细菌的模式菌,黄色粘球菌具备多细胞水平的典型社会性特征,能够进行复杂多样化的细胞行为并贯穿于其生命周期的各个环节,主要包括:在固体介质表面进行的群体细胞运动过程;群体细胞的捕食过程;子实体的发育。其中社会性细胞运动(S... 详细信息

作为粘细菌的模式菌,黄色粘球菌具备多细胞水平的典型社会性特征,能够进行复杂多样化的细胞行为并贯穿于其生命周期的各个环节,主要包括:在固体介质表面进行的群体细胞运动过程;群体细胞的捕食过程;子实体的发育。其中社会性细胞运动(S运动)是黄色粘球菌进行捕食和分化发育的行为基础,其分子机制的解析对黄色粘球菌多细胞水平的社会性行为研究具有重要的理论指导意义。S运动系统主要介导了黄色粘球菌细胞在固体表面的群体运动过程,与铜绿假单胞菌的颤动系统非常类似,胞外多糖(EPS)和Ⅳ型菌毛(TFP)参与的收缩模型是目前普遍接受的S运动分子机制。EPS为TFP的收缩提供了锚定的位点;细胞前导端伸出的TFP细丝抓住附近细胞产生的EPS并激发收缩,从而拉动细胞以粘-滑交替的方式前行。在这一过程中,TFP与EPS这两个胞外生物大分子之间的特异性相互作用的实质是极为重要的科学问题。在本学位论文中,我们对组成TFP的菌毛蛋白PilA与EPS在互作过程中各自参与识别的关键位点进行了探寻。首先,我们利用表面等离子共振的方法,基于直接偶联、多循环动力学-捕获、单循环动力学-捕获以及多循环动力学竞争等手段构建了 PilA-糖类生物大分子体外相互作用的检测体系。首先分析了 EPS天然类似物壳聚糖与PilA蛋白的相互作用。结果显示,不同分子量的壳聚糖均可以通过直接偶联的方式与PilA蛋白相互作用。随后,根据提取方法的不同,我们从黄色粘球菌DK1622菌株中获取了可溶性与不可溶性的EPS,在直接偶联模式下,无论是可溶性还是不可溶性的EPS均与PilA蛋白存在相互作用。直接偶联法由于偶联的方式简单被广泛应用,但是该方法也存在特异性吸附以及蛋白偶联方向不一致导致蛋白结合位点被屏蔽等弊端。因此,我们改进了检测手段,建立了多循环动力学-捕获法以及单循环动力学-捕获法,EPS与PilA蛋白相互作用的阳性信号响应值明显增大。既然EPS与PilA蛋白间存在相互作用,那么EPS参与识别PilA蛋白的关键位点是什么?我们分别检测了参与构成EPS的各个单糖组分与PilA蛋白之间的结合能力。结果显示,含有氨基的单糖能够与PilA蛋白结合,而无修饰的单糖以及N-乙酰修饰的氨基单糖均不能与PilA蛋白结合。该结果与等温滴定量热仪测定的结果一致。同时,基于多循环动力学-捕获法的竞争实验结果显示葡萄糖胺能够与EPS竞争性结合PilA蛋白。另一方面,我们对PilA蛋白参与识别EPS的关键位点也进行了分析。根据生物信息学分析的结果,我们推测PilA蛋白中有22个氨基酸残基位点可能参与了 EPS的识别。从中选取了 3个位点,即Tyr69、Trp146、Trp181,分别将其突变成为Ala。体外互作的结果显示,PilA(W146A、W181A)突变型蛋白和EPS的相互作用与野生型蛋白无差别,而PilA(Y69A)突变型蛋白与氨基糖类的相互作用消失,推测Tyr69可能是PilA蛋白与EPS互作识别时的关键位点。随后,将含有突变位点的全长PilA基因回补到PilA蛋白缺失菌株10410中,结果显示菌株 DK10410::PilAY69A,DK10410::PilAw146A和 DK10410::Pi1Aw181A在固体平板上的S运动能力丧失。在甲基纤维素实验中,菌株DK10410::PilAY69A和DK10410::PilAW146A呈现出一定程度的运动趋势,而菌株DK10410::PilAw181A没有明显运动趋势。Western Blot分析显示,三种回补菌株均没有表面菌毛,菌株菌株DK10410::PilAY69A和DK10410::PilAw146A具有全细胞菌毛蛋白。根据以上实验结果,我们认为Trp146突变后能够产生PilA蛋白,但是PilA蛋白不能进行有效组装,而Trp181突变后不产生任何的PilA蛋白。Tyr69突变后能够产生少量的PilA蛋白,但是PilA蛋白不能进行有效组装。

关键词：黄色粘球菌四型菌毛蛋白胞外多糖分子相互作用关键位点

CLSTN2基因调控猪产仔数的关键位点鉴别及其功能分析

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CLSTN2基因调控猪产仔数的关键位点鉴别及其功能分析

作者：张萍南京农业大学

学位级别：硕士

产仔数是养猪生产中最重要经济性状之一,提高产仔数是生猪养殖的重要目标。二花脸猪作为世界最高产仔记录保持者,是研究猪产仔数性状的优质资源。团队前期研究发现二花脸猪群体内产仔数变异较大,高、低产母猪排卵数和子宫角长度差异显著... 详细信息

产仔数是养猪生产中最重要经济性状之一,提高产仔数是生猪养殖的重要目标。二花脸猪作为世界最高产仔记录保持者,是研究猪产仔数性状的优质资源。团队前期研究发现二花脸猪群体内产仔数变异较大,高、低产母猪排卵数和子宫角长度差异显著,且配种后12d高产组二花脸母猪的子宫冲洗液中Ca浓度显著高于低产组;基于高、低产二花脸母猪60K SNP芯片分型和全基因组关联分析,在猪13号染色体鉴定到显著影响产仔数性状的数量性状基因座（Quantitative trait locus,QTL）,通过增加标记密度和群体量精细定位该QTL区间,鉴别到区间内重要的功能候选基因钙同线蛋白2基因（Calsyntenin 2,CLSTN2）。CLSTN2基因作为钙结合蛋白家族成员,主要参与细胞交流与信号传导。Ca能够维持细胞膜两侧电位平衡,参与调控卵巢发育、早期胚胎的附植,并调节促性腺激素等相关类固醇激素的作用。团队前期在配种后12d高、低产二花脸猪子宫内膜组织RNA-seq测序结果中发现,在CLSTN2基因第10内含子有一段120bp片段表达,将其命名为CLSTN2-intron10-RNA,该新转录本编码的多肽与RPLP1（60S酸性核糖体蛋白P1）蛋白序列相似性达89%;从DNA水平,CLSTN2基因第10内含子上存在与RPLP1基因m RNA序列相似度高达93%的DNA序列,推测CLSTN2-intron10-RNA可能是RPLP1基因的加工假基因,该假基因序列实际表达约120bp;对CLSTN2基因第10内含子包含RPLP1假基因全部序列扩增后鉴别到8个SNP位点,其中5个SNP位点（rs321908502、rs327480278、rs338346173、rs321428961以及rs336936053）与二花脸猪产仔数显著相关,但这些位点是否为影响产仔数的功能位点未知。CLSTN2基因调控二花脸猪产仔数变异的功能位点及其调控产仔数的遗传机制有待深入挖掘。本研究首先从基因组水平对CLSTN2基因第10内含子鉴定到的5个SNP位点进一步在美国、加拿大、丹麦以及法国大白猪中验证,随后,利用二花脸猪重测序数据,鉴定CLSTN2基因编码和调控区内可能影响二花脸猪产仔数的功能SNP,并在二花脸群体进行验证;其次,从转录和蛋白水平,在不同时期高、低产二花脸母猪子宫及卵巢组织对CLSTN2进行差异表达分析;最后,通过免疫组织化学确定CLSTN2蛋白表达的细胞定位,再从细胞水平分析干扰CLSTN2基因表达后其调控的基因变化,初步解析CLSTN2基因可能影响猪产仔数变异的机理。本研究的主要结果如下:***2基因多态性与产仔数的关联性分析本试验首先将CLSTN2基因第10内含子上的5个SNP位点在美国、加拿大、丹麦、法国大白猪群体中验证,结果发现:rs321908502位点显著影响美国、加拿大和法国大白猪的产仔数,但该位点与丹麦大白猪产仔数不相关;rs321428961、rs336936053位点显著影响美国大白猪的产仔数,且rs321428961位点与加拿大大白猪经产胎次的产活仔数显著相关;rs338346173位点与丹麦大白猪经产胎次的总产仔数极显著相关。随后,根据二花脸猪产仔数育种值,挑选极端高、低产各20头二花脸猪,并基于case-control分析初步鉴别CLSTN2基因显著影响高、低产二花脸猪产仔数的功能SNP,最后,将显著位点进一步在二花脸猪全群验证。结果显示,利用二花脸重测序鉴别到CLSTN2基因编码区有12个SNP且都为同义突变,3’UTR区鉴别到5个SNP,但启动子、5’UTR区未发现SNP。关联分析显示,CLSTN2基因3’UTR区的rs323588696、rs322192464两个位点与极端高、低产二花脸猪的产仔数显著相关,但与二花脸猪群体产仔数不相关。***2基因在不同时期高、低产的二花脸猪卵巢和子宫组织中差异表达分析通过选择高、低产二花脸母猪子代182d的卵巢和子宫内膜组织进行RNA-seq测序发现,在子宫内膜组织RNA-seq结果鉴别到的差异表达基因中未发现CLSTN2,但在卵巢组织的RNA-seq结果中有736个基因在高、低产组间差异表达（P1）,CLSTN2基因为下调基因,该基因在低产组表达量比高产组高,而且我们通过定量和蛋白分析也验证了CLSTN2基因经典转录本编码蛋白在子代182d高、低产母猪卵巢存在差异表达。上述736个差异表达基因中,与CLSTN2基因表达显著相关的基因包括ANGPT1、DSG2、BMP15、HSD17B12、HSD17B1等88个。736个差异基因通过KEGG和GO富集到了315个显著的GO术语和57条显著的信号通路。其中,CLSTN2基因本身未富集

关键词：二花脸猪产仔数关键位点 CLSTN2基因

广义多样性增量结合关键位点对核小体定位预测作用的研究

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广义多样性增量结合关键位点对核小体定位预测作用的研究

作者：周云鹏内蒙古大学

学位级别：硕士

研究核小体在基因组上精确位置的定位,对于深入理解多种生物学过程具有十分重要的意义。基于已有的海量实验数据,结合数理统计和机器学习方法,发展核小体的预测模型,是当下生物信息学的热点研究领域。核小体定位理论虽然取得了一定进展... 详细信息

研究核小体在基因组上精确位置的定位,对于深入理解多种生物学过程具有十分重要的意义。基于已有的海量实验数据,结合数理统计和机器学习方法,发展核小体的预测模型,是当下生物信息学的热点研究领域。核小体定位理论虽然取得了一定进展,但是依然无法精准确定核小体的位置。我们需要进一步借助于实验手段,提高核小体定位的精确度。论文提出了广义多样性增量及关键位点算法,并围绕广义多样性增量、关键位点结合支持向量机提出了DNA的预测模型。主要研究内容如下：(1) 提出核心DNA中关键位点的概念,并基于核心DNA中的k-mer频数信息,结合支持向量机,提出了基于关键位点的核小体定位模型。模型对酵母核心DNA和连接DNA进行了分类预测,关键位点结合ID-SVM模型预测准确度达到了72.56%。(2) 在多样性增量的基础上提出了广义多样性增量,并结合核心DNA中k-mer频率信息,提出了广义多样性增量结合关键位点的核小体定位预测模型。模型对酵母核心DNA和连接DNA序列进行分类预测,实验表明该模型具有良好的预测效果,gID-SVM预测准确度达到了85.35%,关键位点结合gID-SVM模型预测准确度达到了82.53%。(3) 将预测模型应用于其他物种中,结合关键位点和广义多样性增量对鸡类的亲和度高的DNA序列和亲和度低的DNA进行了预测,实验的预测结果良好,关键位点结合ID-SVM模型准确率为89.03%,gID-SVM预测准确度为93.13%,关键位点结合gID-SVM模型预测准确度为90.80%。进而比较了酵母和鸡的核心DNA的关键位点,得到生物普遍性、不同物种间的核小体关键位点规律类似、除关键位点外的其他核心DNA位点决定了物种性状的多样性的重要规律。

关键词：核小体定位广义多样性增量核心DNA 关键位点支持向量机

以TRAF2为样本检验证实的一种通过模式关键位点研究未知蛋白质功能的方法

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湖北医药学院学报 2013年第5期32卷 403-408页

作者：曾凡龙卫荣华朱敬沈君豪湖北医药学院医学生物学教研室湖北十堰442000

目的:以肿瘤坏死因子受体相关因子2(TNF receptor-associated factor,TRAF2)为试验对象验证改良的PROSITE计算机模拟生物学法的正确性,用于探测基因组中大量的未知功能基因。方法:修改PROSITE的模式,并创建相应的数据库,选择模式的关键... 详细信息

目的:以肿瘤坏死因子受体相关因子2(TNF receptor-associated factor,TRAF2)为试验对象验证改良的PROSITE计算机模拟生物学法的正确性,用于探测基因组中大量的未知功能基因。方法:修改PROSITE的模式,并创建相应的数据库,选择模式的关键氨基酸来探索TRAF2的功能。通过利用过滤机制排除干扰因素,模式中的关键位点即可探测蛋白质的主要功能。结果:TRAF2的核心氨基酸位于GLN311到LEU501,其单体状态时无功能,三聚体或六聚体时能行使功能。当它行使功能时,活性位点位于三聚体的中央。且其行使信号转导功能时,会出现在膜附近,这有利于通过细胞骨架与膜结合。此外,相对于比较简单的蛋白质,复杂结构的蛋白质拥有更多的模式,即功能更多。结论:改良的PROSITE法能够探测蛋白质的基本结构类型,从而推断和预测蛋白质的功能;结合其他实验证据,可以方便地探测蛋白质的功能,是一种有效的探索未知功能蛋白质的计算机模拟生物学解决方案。

关键词：肿瘤坏死因子受体相关因子2 活性位点模式关键位点

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基于Bcl-2蛋白关键位点抑制剂的研究

华西药学杂志 2017年第4期32卷 347-353页

作者：张自阔李河川何谷范举正四川大学华西药学院四川成都610041 成都睿智化学研究有限公司四川成都610000 四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室四川成都610041

目的设计并合成高抑制活性的小分子Bcl-2蛋白抑制剂。方法基于已报道的活性小分子,运用Autodock 4.2软件研究其与Bcl-2蛋白的作用模式,探索Bcl-2蛋白的关键位点并设计、合成一系列新型小分子抑制剂,并进行体外抗肿瘤活性的实验。结果设... 详细信息

目的设计并合成高抑制活性的小分子Bcl-2蛋白抑制剂。方法基于已报道的活性小分子,运用Autodock 4.2软件研究其与Bcl-2蛋白的作用模式,探索Bcl-2蛋白的关键位点并设计、合成一系列新型小分子抑制剂,并进行体外抗肿瘤活性的实验。结果设计合成了8个全新的小分子化合物,其结构经1HNMR和13CNMR确证。结论所合成的8个化合物均有明显的体外抗肿瘤活性,且大部分高于阳性对照紫杉醇。

关键词： Bcl-2 蛋白抑制剂晶体结构 Autodock 4.2 活性区域关键位点 Docking 抗肿瘤活性紫杉醇

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基于分子动力学模拟研究YTHDF3与m6A修饰RNA的相互作用动力学及关键位点

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计算生物学 2022年第3期12卷 32-39页

作者：周文雪韩中杰吴志祥李春华北京工业大学环境与生命学部北京

YTHDF3 (YTH domain family protein 3)能够特异性识别N6-甲基腺嘌呤(N6-methylladenosine, m6A)修饰的RNA,参与调控mRNA加工代谢、正常生理和异常病理等重要生命进程,与许多癌症息息相关。研究YTHDF3与m6A修饰RNA的相互作用动力学及关... 详细信息

YTHDF3 (YTH domain family protein 3)能够特异性识别N6-甲基腺嘌呤(N6-methylladenosine, m6A)修饰的RNA,参与调控mRNA加工代谢、正常生理和异常病理等重要生命进程,与许多癌症息息相关。研究YTHDF3与m6A修饰RNA的相互作用动力学及关键位点具有重要意义。在本工作中,采用分子动力学(Molecular dynamics, MD)模拟方法研究了YTHDF3单体及与甲基化RNA复合物的动力学性质。研究发现,甲基化RNA的结合使得YTHDF3结构更加紧凑,构象更加稳定。运动相关性分析揭示了YTHDF3上负责结合甲基化RNA的重要区域。最后,构造运动相关性加权的复杂网络,识别了参与m6A修饰特异性识别的关键残基,与实验结果高度吻合。另外,还识别了一些远离结合界面但对结构稳定发挥重要功能的残基。本研究有助于理解YTHDF3与m6A修饰RNA之间的相互作用和关键位点,可为靶向药物设计提供重要信息。

关键词：特异性识别靶向药物关键位点生命进程甲基化复杂网络分子动力学模拟

灵芝中透明质酸酶的异源表达及关键残基位点的确定

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灵芝中透明质酸酶的异源表达及关键残基位点的确定

作者：董钢印吉林农业大学

学位级别：硕士

透明质酸酶(Hyaluronidase,HAase)是一种能够降解透明质酸(Hyaluronic acid,HA)的糖苷酶,主要作用于β-1,3糖苷键或β-1,4糖苷键,在一定程度上还可催化软骨素和硫酸软骨素。在临床医疗、制革工艺等方面有着广泛的应用,同时作为制备低分... 详细信息

透明质酸酶(Hyaluronidase,HAase)是一种能够降解透明质酸(Hyaluronic acid,HA)的糖苷酶,主要作用于β-1,3糖苷键或β-1,4糖苷键,在一定程度上还可催化软骨素和硫酸软骨素。在临床医疗、制革工艺等方面有着广泛的应用,同时作为制备低分子量透明质酸的主要制剂而引起人们的广泛关注。目前,对透明质酸酶的研究主要集中在动物和细菌方面,对真菌中透明质酸酶的研究报道甚少,因此本文对大型真菌灵芝中的透明质酸酶进行异源表达、酶学性质研究及定点突变,以期对透明质酸酶的研究提供有利的理论依据。主要研究内容和结果如下:1.透明质酸酶重组质粒的构建及异源表达通过NCBI数据库获取灵芝的透明质酸酶基因序列(Gen Bank:LR729866.1),设计引物后运用PCR技术获取目的基因,其大小为1683 bp,以pET-15b为载体构建重组质粒,并将其命名为pET-15b-HAase,然后转化入大肠杆菌BL21中进行诱导表达,利用亲和层析原理通过Ni-NTA柱进行纯化,经SDS-PAGE检测分析,目标蛋白大小约为62 k Da。2.野生型酶学性质表征通过还原糖检测法(DNS法)对野生型酶学性质进行研究,其最适反应温度为40℃;最适p H值为5.0;底物特异性结果显示对透明质酸的活力最高,并对硫酸软骨素也有一定的降解效果;金属离子中一价K、二价Mg、Cu和三价Al随着浓度的增加,对酶的抑制效果增强,其中Cu抑制效果最明显,Na随着浓度的增加对酶的抑制效果反而减小,三价Fe在低浓度时具有明显的激活作用,随着浓度的增加也呈现出抑制趋势;有机溶剂中甲醇和丙三醇呈现出低浓度促进高浓度抑制的趋势,乙醇和二甲基亚砜随着浓度的增加抑制效果越强;以透明质酸为底物,其酶促反应动力学曲线符合米氏方程,在最适反应条件下Km=0.502 mg/m L,Vmax=1.419μmol/m L/min。3.关键残基位点的确定利用生物信息学进行分析,通过同源模建技术构建透明质酸酶的三维结构。运用在线评估网站SAVES对模型进行评估,选择最高分模型与底物HA进行对接,结合同源序列比对确定重要的的保守位点,最终选取第79位精氨酸残基作为突变位点,采用全质粒PCR技术进行定点突变,获得突变体R79A。4.突变体R79A酶学性质表征通过还原糖检测法对突变体R79A进行酶学性质表征,其最适反应温度为37℃;最适反应p H为5.0;底物特异性结果显示对硫酸软骨素降解效果优于透明质酸;所有的金属离子都呈现抑制作用,抑制程度二价>三价>一价;所测的四种有机溶剂呈现出低浓度抑制,高浓度促进的趋势,其中效果最明显的为二甲基亚砜;以透明质酸为底物,经米氏方程测得动力学参数分别为Km=0.591 mg/m L,Vmax=1.154μmol/m L/min。通过野生型与突变体的酶学性质对比,发现酶的部分性质发生了变化,其中最适反应p H没有明显变化,最适反应温度有微弱的变化,由40℃降低为37℃。对金属离子变得十分敏感,同时降解硫酸软骨素的能力极大提升。通过酶促反应动力学观察发现,突变体Km变大,说明对底物的亲和力减弱,不利于酶与底物的亲核进攻。根据酶活性质的变化推测位于第79位点的精氨酸可能在底物的特异性识别中起到了重要作用。

关键词：透明质酸酶异源表达关键位点

肉食兽阿留申病毒VP2和NS1蛋白功能区回顾及比较分析

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病毒学报 2020年第4期36卷 726-734页

作者：吴艳虹韦韬丛丽赵永强邵西群中国农业科学院特产研究所长春130112

水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,AMDV)是引起水貂阿留申病(Aleutian mink disease,AD)的病原体,归属肉食兽阿留申病毒基因I型,是主要研究的阿留申病毒种。AMDV结构蛋白VP2与病毒趋性、致病性和宿主范围密切相关,非结构蛋白... 详细信息

水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,AMDV)是引起水貂阿留申病(Aleutian mink disease,AD)的病原体,归属肉食兽阿留申病毒基因I型,是主要研究的阿留申病毒种。AMDV结构蛋白VP2与病毒趋性、致病性和宿主范围密切相关,非结构蛋白NS1在病毒的复制、转录调控和衣壳组装过程中起重要作用。本文首先回顾了与AMDV的复制、致病性、宿主范围和抗原性相关的VP2、NS1功能位点及区段的研究进展,在此基础上,与近年来发现的其它5种肉食兽阿留申病毒对应位点、区段进行比对分析,有助于认识肉食兽阿留申病毒蛋白功能区的自然变异和预测病毒的未知功能区,为阿留申病毒的蛋白功能研究和疫苗株筛选提供新的视角。

关键词：水貂阿留申病毒(AMDV) 阿留申病毒结构蛋白VP2 非结构蛋白NS1 生物学功能区段关键位点

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TastepeptidesDM:集成对接和分子描述符结合机器学习揭示T1Rs受体的保守位点和识别机制

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TastepeptidesDM:集成对接和分子描述符结合机器学习揭示T1Rs受体...