CLSTN2基因调控猪产仔数的关键位点鉴别及其功能分析
作者单位：南京农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：李平华
授予年度：2022年
摘 要：产仔数是养猪生产中最重要经济性状之一,提高产仔数是生猪养殖的重要目标。二花脸猪作为世界最高产仔记录保持者,是研究猪产仔数性状的优质资源。团队前期研究发现二花脸猪群体内产仔数变异较大,高、低产母猪排卵数和子宫角长度差异显著,且配种后12d高产组二花脸母猪的子宫冲洗液中Ca浓度显著高于低产组;基于高、低产二花脸母猪60K SNP芯片分型和全基因组关联分析,在猪13号染色体鉴定到显著影响产仔数性状的数量性状基因座（Quantitative trait locus,QTL）,通过增加标记密度和群体量精细定位该QTL区间,鉴别到区间内重要的功能候选基因钙同线蛋白2基因（Calsyntenin 2,CLSTN2）。CLSTN2基因作为钙结合蛋白家族成员,主要参与细胞交流与信号传导。Ca能够维持细胞膜两侧电位平衡,参与调控卵巢发育、早期胚胎的附植,并调节促性腺激素等相关类固醇激素的作用。团队前期在配种后12d高、低产二花脸猪子宫内膜组织RNA-seq测序结果中发现,在CLSTN2基因第10内含子有一段120bp片段表达,将其命名为CLSTN2-intron10-RNA,该新转录本编码的多肽与RPLP1（60S酸性核糖体蛋白P1）蛋白序列相似性达89%;从DNA水平,CLSTN2基因第10内含子上存在与RPLP1基因m RNA序列相似度高达93%的DNA序列,推测CLSTN2-intron10-RNA可能是RPLP1基因的加工假基因,该假基因序列实际表达约120bp;对CLSTN2基因第10内含子包含RPLP1假基因全部序列扩增后鉴别到8个SNP位点,其中5个SNP位点（rs321908502、rs327480278、rs338346173、rs321428961以及rs336936053）与二花脸猪产仔数显著相关,但这些位点是否为影响产仔数的功能位点未知。CLSTN2基因调控二花脸猪产仔数变异的功能位点及其调控产仔数的遗传机制有待深入挖掘。本研究首先从基因组水平对CLSTN2基因第10内含子鉴定到的5个SNP位点进一步在美国、加拿大、丹麦以及法国大白猪中验证,随后,利用二花脸猪重测序数据,鉴定CLSTN2基因编码和调控区内可能影响二花脸猪产仔数的功能SNP,并在二花脸群体进行验证;其次,从转录和蛋白水平,在不同时期高、低产二花脸母猪子宫及卵巢组织对CLSTN2进行差异表达分析;最后,通过免疫组织化学确定CLSTN2蛋白表达的细胞定位,再从细胞水平分析干扰CLSTN2基因表达后其调控的基因变化,初步解析CLSTN2基因可能影响猪产仔数变异的机理。本研究的主要结果如下:***2基因多态性与产仔数的关联性分析本试验首先将CLSTN2基因第10内含子上的5个SNP位点在美国、加拿大、丹麦、法国大白猪群体中验证,结果发现:rs321908502位点显著影响美国、加拿大和法国大白猪的产仔数,但该位点与丹麦大白猪产仔数不相关;rs321428961、rs336936053位点显著影响美国大白猪的产仔数,且rs321428961位点与加拿大大白猪经产胎次的产活仔数显著相关;rs338346173位点与丹麦大白猪经产胎次的总产仔数极显著相关。随后,根据二花脸猪产仔数育种值,挑选极端高、低产各20头二花脸猪,并基于case-control分析初步鉴别CLSTN2基因显著影响高、低产二花脸猪产仔数的功能SNP,最后,将显著位点进一步在二花脸猪全群验证。结果显示,利用二花脸重测序鉴别到CLSTN2基因编码区有12个SNP且都为同义突变,3’UTR区鉴别到5个SNP,但启动子、5’UTR区未发现SNP。关联分析显示,CLSTN2基因3’UTR区的rs323588696、rs322192464两个位点与极端高、低产二花脸猪的产仔数显著相关,但与二花脸猪群体产仔数不相关。***2基因在不同时期高、低产的二花脸猪卵巢和子宫组织中差异表达分析通过选择高、低产二花脸母猪子代182d的卵巢和子宫内膜组织进行RNA-seq测序发现,在子宫内膜组织RNA-seq结果鉴别到的差异表达基因中未发现CLSTN2,但在卵巢组织的RNA-seq结果中有736个基因在高、低产组间差异表达（P1）,CLSTN2基因为下调基因,该基因在低产组表达量比高产组高,而且我们通过定量和蛋白分析也验证了CLSTN2基因经典转录本编码蛋白在子代182d高、低产母猪卵巢存在差异表达。上述736个差异表达基因中,与CLSTN2基因表达显著相关的基因包括ANGPT1、DSG2、BMP15、HSD17B12、HSD17B1等88个。736个差异基因通过KEGG和GO富集到了315个显著的GO术语和57条显著的信号通路。其中,CLSTN2基因本身未富集
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