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脂多糖和肿瘤坏死因子α对人牙髓干细胞增殖和成骨分化的影响

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山西医科大学学报 2024年第3期55卷 340-346页

作者：刘岩刘昕昕石刘李婉怡费立崑徐州医科大学口腔医学院口腔内科教研室徐州221004 徐州医科大学附属口腔医院牙周黏膜病科

目的探讨脂多糖(LPS)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)对人牙髓干细胞(hDPSCs)增殖和分化的影响。方法体外分离培养hDPSCs,分别用不同浓度LPS(0,0.1,1,10μg/mL)和TNF-α(0,1,10,100 ng/mL)培养细胞。培养24,48,72 h,应用细胞计数试剂盒-8(CCK... 详细信息

目的探讨脂多糖(LPS)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)对人牙髓干细胞(hDPSCs)增殖和分化的影响。方法体外分离培养hDPSCs,分别用不同浓度LPS(0,0.1,1,10μg/mL)和TNF-α(0,1,10,100 ng/mL)培养细胞。培养24,48,72 h,应用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测hDPSCs增殖活性变化;培养7,14,21 d应用茜素红(AR)染色试剂盒和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(BCIP)/氯化硝基四氮唑蓝(NBT)碱性磷酸酯酶(ALP)显色试剂盒检测hDPSCs肉眼观AR染色变化、钙结节定量、ALP染色和ALP活性等成骨分化指标。结果①CCK-8实验显示1,10,100 ng/mL TNF-α作用于hDPSCs 24,48,72 h后细胞增殖活力降低(P细胞增殖活性没有明显差异,而1μg/mL和10μg/mL组LPS作用hDPSCs 72 h后OD_(450)值大于0μg/mL组(P<0.05)。ALP成骨诱导染色显示培养7,14,21 d,不同浓度LPS作用后ALP染色和ALP活性变化不明显。AR成骨诱导染色显示培养7 d,LPS各浓度组的矿化程度不明显;10μg/mL LPS培养14,21 d矿化程度较0μg/mL低(P<0.05)。结论LPS对hDPSCs成骨分化的影响取决于LPS浓度和作用时间,高浓度LPS促进hDPSCs增殖。TNF-α抑制hDPSCs的增殖和成骨分化。

关键词：脂多糖肿瘤坏死因子α 人牙髓干细胞牙髓炎成骨分化

Let-7a对人牙髓干细胞增殖、凋亡和成骨分化的影响

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上海口腔医学 2023年第5期32卷 468-474页

作者：刘岩单丹妮孙晶邹雨希袁长永徐州医科大学江苏徐州221004 徐州医科大学附属口腔医院江苏徐州221002 南京大学医学院附属口腔医院南京市口腔医院江苏南京210008

目的:研究let-7a对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)增殖、成骨分化、凋亡的影响及可能的作用机制。方法:通过let-7a mimics、let-7a agomir及let-7a inhibitor转染hDPSCs。将细胞分为4组,过表达对照组(let-7a control组/let-7a agomir control组)、过表达let-7a组(let-7a mimics组/let-7a agomir组)、敲低let-7a对照组(let-7a inhibitor control组)和敲低let-7a组(let-7a inhibitor组)。CCK-8法检测细胞在转染后继续培养24、48、72 h的增殖情况,茜素红染色检测钙化结节。Western印迹法检测细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、4E-结合蛋白(4E-binding protein 1,4EBP1)、p-4EBP1、哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)和p-mTOR蛋白表达。Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒检测转染后的细胞凋亡水平。采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析。结果:Let-7a抑制hDPSCs增殖,对细胞成骨向分化和凋亡具有促进作用。Let-7a可下调细胞内4EBP1、p-4EBP1、mTOR和p-mTOR的表达水平。结论:Let-7a可能通过抑制mTOR-4EBP1分子通路,从而抑制hDPSCs增殖,促进其成骨分化和凋亡。

关键词： let-7a 人牙髓干细胞增殖分化凋亡

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人牙髓干细胞无血清培养方法的研究进展

国际口腔医学杂志 2022年第2期49卷 220-226页

作者：付恒怡汪成林口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科成都610041

人牙髓干细胞是再生医学中的主要细胞来源之一,具有多向分化潜能,已经被应用于治疗多种疾病,包括Ⅰ型糖尿病、神经系统疾病等。为满足临床需求,牙髓干细胞需进行体外扩增。常规的牙髓干细胞体外扩增方法需要运用添加胎牛血清的培养基,... 详细信息

人牙髓干细胞是再生医学中的主要细胞来源之一,具有多向分化潜能,已经被应用于治疗多种疾病,包括Ⅰ型糖尿病、神经系统疾病等。为满足临床需求,牙髓干细胞需进行体外扩增。常规的牙髓干细胞体外扩增方法需要运用添加胎牛血清的培养基,但近些年来由于胎牛血清存在伦理和安全两方面的问题,推荐使用无血清培养方法。本文对无血清培养基培养人牙髓干细胞的组成及方法,及其培育出的细胞的特性和其他相关应用进行综述。

关键词：人牙髓干细胞无血清培养干细胞特性

不同来源条件培养基对人牙髓干细胞增殖的影响

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中国组织工程研究 2023年第1期27卷 49-53页

作者：杨燕王静娴张荣红李晨范安然崔冬冰吴淑梅贵州医科大学贵州省贵阳市550004 长江航运总医院湖北省武汉市430014 贵州省第二人民医院贵州省贵阳市550004

背景:利用条件培养基与人牙髓干细胞共培养,初步探索可以快速促进人牙髓干细胞增殖的方法,为今后细胞治疗、扩增高质量种子细胞提供研究基础。目的:初步探究不同来源条件培养基对人牙髓干细胞增殖的影响。方法:体外分离培养人牙髓干细胞... 详细信息

背景:利用条件培养基与人牙髓干细胞共培养,初步探索可以快速促进人牙髓干细胞增殖的方法,为今后细胞治疗、扩增高质量种子细胞提供研究基础。目的:初步探究不同来源条件培养基对人牙髓干细胞增殖的影响。方法:体外分离培养人牙髓干细胞,并用流式细胞术鉴定。然后将胎牛血清超高速低温离心产物、骨折患者尿液超高速低温离心产物、骨髓来源树突状细胞体外培养上清液、人皮肤成纤维细胞培养上清液与低糖DMEM培养液配置成条件培养基后,再分别与人牙髓干细胞共培养,使用细胞无标记培养观察装置(BioStation-T)连续拍摄各组细胞生长72 h的照片、使用实时无标记细胞分析仪(RTCA)动态监测150 h,比较各组细胞的标准化细胞指数值的差异。结果与结论:①人牙髓干细胞为典型的间充质干细胞形态,表达间充质干细胞表面标志物CD90和CD105,不表达CD34和CD45;②细胞无标记培养观察装置动态监测时,发现胎牛血清超高速低温离心组的颗粒物质被吸收时间要显著早于其他实验组和空白对照组;③在实时无标记细胞分析仪检测时,与空白对照组相比,胎牛血清超高速低温离心组、骨髓来源树突状细胞体外培养上清液组、人皮肤成纤维细胞培养上清液组的标准化细胞指数值均显著升高(P细胞指数值显著降低(P细胞体外培养上清液、人皮肤成纤维细胞培养上清液所配置的条件培养基能促进人牙髓干细胞增殖,其中胎牛血清超高速低温离心产物所配置的条件培养基对细胞还有一定保护作用。

关键词：人牙髓干细胞超高速低温离心条件培养基细胞增殖标准化细胞指数组织块培养法

去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用

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中国组织工程研究 2022年第7期26卷 1012-1019页

作者：周颖张幻廖松胡凡琦易静刘玉斌靳继德中国人民解放军军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所北京市100850 广西医科大学附属肿瘤医院乳腺及骨、软组织肿瘤内科广西壮族自治区南宁市530021 中国人民解放军总医院北京市100853

背景:免疫排斥是组织和器官移植面临的巨大挑战,免疫抑制剂的使用常给患者带来严重的不良反应,间充质干细胞的免疫抑制作用为免疫排斥的治疗带来新的希望。目的:探讨去铁胺和干扰素γ对人牙髓干细胞免疫调节能力的影响。方法:用去铁胺... 详细信息

背景:免疫排斥是组织和器官移植面临的巨大挑战,免疫抑制剂的使用常给患者带来严重的不良反应,间充质干细胞的免疫抑制作用为免疫排斥的治疗带来新的希望。目的:探讨去铁胺和干扰素γ对人牙髓干细胞免疫调节能力的影响。方法:用去铁胺、干扰素γ以及二者联合预处理人牙髓干细胞,CCK-8检测细胞增殖能力,Q-PCR检测相关基因mRNA的表达,ELISA检测培养上清中炎性因子水平;预处理后的人牙髓干细胞与CFSE标记的小鼠脾淋巴细胞共培养,流式细胞术检测脾淋巴细胞的增殖能力。建立小鼠异体皮肤移植模型,经尾静脉注射PBS或不同预处理的人牙髓干细胞,记录移植皮肤存活时间,进行组织病理学和免疫组化分析,检测移植小鼠脾脏Treg细胞比例。结果与结论:①去铁胺和干扰素γ预处理均抑制了人牙髓干细胞的生长,去铁胺生长抑制作用更为明显;②去铁胺联合干扰素γ预处理明显提高了血管内皮生长因子、白细胞介素6、转化生长因子β1、环氧合酶2、人类白细胞抗原G、肿瘤坏死因子Α诱导蛋白6和白细胞介素10基因表达,促进了白细胞介素6、转化生长因子β1和前列腺素E2的分泌;③体内实验结果证实,去铁胺联合干扰素γ预处理的人牙髓干细胞可以延长小鼠异体移植皮肤存活时间,减轻了移植皮片处CD4^(+)T、CD8^(+)T以及巨噬细胞的浸润,促进了受体小鼠脾脏中Treg细胞增加;④研究结果表明,经去铁胺联合干扰素γ预处理后,人牙髓干细胞的免疫调节作用明显增强,减轻了皮肤移植免疫排斥反应。

关键词：干细胞人牙髓干细胞去铁胺干扰素γ 皮肤移植免疫调节免疫排斥

人牙髓干细胞条件培养基通过AMPK/PGC-1α途径改善氯化钴诱导的颏舌肌成肌细胞低氧损伤

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上海口腔医学 2020年第6期29卷 573-579页

作者：张维华於丽明韩欣欣潘杰邓佳佳朱露莹刘月华复旦大学附属口腔医院上海市口腔病防治院上海200001 复旦大学附属口腔医院口腔生物医学工程实验室上海200001 中南大学﹑湘雅口腔医学院中南大学湘雅口腔医院湖南长沙410000

目的:研究氯化钴(CoCl2)模拟的低氧对颏舌肌成肌细胞活性和氧化应激的影响,探讨人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)条件培养基(conditioned medium,CM)保护作用的机制与AMPK/PGC-1α通路的关系。方法:分离、培养及鉴定h... 详细信息

目的:研究氯化钴(CoCl2)模拟的低氧对颏舌肌成肌细胞活性和氧化应激的影响,探讨人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)条件培养基(conditioned medium,CM)保护作用的机制与AMPK/PGC-1α通路的关系。方法:分离、培养及鉴定hDPSCs,通过超滤浓缩法提取条件培养基;分离、培养小鼠颏舌肌成肌细胞,分为对照组、CM组、CoCl2组、CoCl2+CM组。采用CCK-8法检测颏舌肌成肌细胞的活性,分别使用DCFH-DA和MitoSOX Red评估细胞内和线粒体活性氧((reac)tive oxygen species,ROS)水平,实时定量PCR分析NRF-1、NRF-2线粒体相关基因的表达,Western印迹法检测PGC-1α、p-AMPK、总AMPK蛋白表达。采用SPSS 22.0软件包对数据进行统计学分析。结果:颇舌肌成肌细胞经过200μmol/L CoCl2处理24 h后增殖显著下降(P细胞内和线粒体内ROS含量显著上升(P细胞活性显著增加(P细胞中pAMPK和PGC-1α蛋白的表达水平以及PGC-1α下游的线粒体效应物NRF-1、NRF-2的mRNA表达水平(P人牙髓干细胞条件培养基能减轻CoCl2诱导的颏舌肌成肌细胞低氧损伤,其机制可能与AMPK/PGC-1α通路的调节有关。

关键词：人牙髓干细胞条件培养基颏舌肌低氧活性氧 AMPK/PGC-1α通路

低氧预处理人牙髓干细胞移植对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑白质损伤的影响

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中国现代医学杂志 2023年第12期33卷 24-32页

作者：武沐洋王晓莉高淑君张浩肖培伦王凡涛潍坊医学院口腔医学院山东潍坊261053 潍坊医学院医学影像学院山东潍坊261053 潍坊医学院基础医学院山东潍坊261053 潍坊医学院附属医院口腔科山东潍坊261053

目的探讨低氧预处理人牙髓干细胞移植(H-hDPSCs)对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠脑白质损伤及内源性神经干细胞的影响。方法将健康7 d龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为假手术组、HIBD组、常氧培养hDPSC移植组(N-hDPSCs组)及低氧预处... 详细信息

目的探讨低氧预处理人牙髓干细胞移植(H-hDPSCs)对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠脑白质损伤及内源性神经干细胞的影响。方法将健康7 d龄Sprague-Dawley新生大鼠随机分为假手术组、HIBD组、常氧培养hDPSC移植组(N-hDPSCs组)及低氧预处理hDPSC移植组(H-hDPSCs组),每组11只。采用经典的Rice-Vannucci法复制HIBD模型。模型复制后7 d采用增殖细胞核抗原(PCNA)/巢蛋白(Nestin)免疫荧光双标法检测大鼠侧脑室室管膜下区内源性神经干细胞(NSCs)的增殖;模型复制后3周,滑竿实验、Y迷宫实验及模型复制后4周Morris水迷宫实验检测大鼠的运动及空间记忆能力;行为学实验后采用神经元特异性核蛋白(NeuN)免疫荧光法检测大鼠脑组织皮层和海马CA1区神经元的表达;采用髓鞘碱性蛋白(MBP)及神经纤维丝蛋白重链(NF200)免疫荧光双标法检测纹状体及胼胝体区髓鞘及神经纤维的表达。结果HIBD组模型复制后7 d的侧脑室室管膜下区增殖NSCs数较假手术组少(P细胞数较HIBD组多(P<0.05),但较假手术组少(P<0.05),N-hDPSCs组较H-hDPSCs组少(P<0.05)。N-hDPSCs组、H-hDPSCs组纹状体、胼胝体区MBP、NF200蛋白平均荧光强度高于HIBD组(P<0.05),但低于假手术组(P<0.05),H-hDPSCs组高于N-hDPSCs组(P<0.05)。结论HhDPSCs与N-hDPSCs移植可有效改善HIBD新生大鼠远期行为学,并促进HIBD新生大鼠内源性NSCs的增殖,减轻脑白质损伤进而促进HIBD神经修复,且H-hDPSCs移植的疗效优于N-hDPSCs。

关键词：低氧预处理人牙髓干细胞缺氧缺血性脑损伤脑白质损伤新生大鼠

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低氧浓度促进人牙髓干细胞增殖及神经分化

中国组织化学与细胞化学杂志 2022年第2期31卷 133-138页

作者：张浩高淑君武沐洋李睿宁肖培伦于树娜王晓莉王凡涛潍坊医学院口腔医学院潍坊261053 潍坊医学院医学影像学院潍坊261053 潍坊医学院基础医学院潍坊261053 兰州大学第二临床医学院兰州730000

目的探讨不同氧浓度对人牙髓干细胞(hDPSCs)增殖及神经分化的影响,为hDPSCs的临床应用提供依据。方法无菌收集正畸减数牙及完整拔除的智齿,组织块酶消化法分离培养人牙髓干细胞,随机分为4组,设置氧浓度分别为1%、5%、10%及21%。5-乙炔... 详细信息

目的探讨不同氧浓度对人牙髓干细胞(hDPSCs)增殖及神经分化的影响,为hDPSCs的临床应用提供依据。方法无菌收集正畸减数牙及完整拔除的智齿,组织块酶消化法分离培养人牙髓干细胞,随机分为4组,设置氧浓度分别为1%、5%、10%及21%。5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)标记法检测各组人牙髓干细胞的增殖,CCK-8法检测细胞活力;观察各组人牙髓干细胞神经诱导后的形态学变化,细胞免疫荧光法检测各组人牙髓干细胞神经诱导后细胞巢蛋白(Nestin)的表达。结果人牙髓干细胞鉴定结果示CD90^(+)、CD146^(+)、CD34^(-);体外培养24 h时,5%O_(2)组人牙髓干细胞增殖率及细胞活力显著高于1%O_(2)、10%O_(2)和21%O_(2)组;神经诱导5 d,各组细胞形态均诱导为神经元样,5%O_(2)组细胞突起数及Nestin的表达显著高于1%O_(2)、10%O_(2)和21%O_(2)组。结论5%O_(2)及10%O_(2)均可促进人牙髓干细胞增殖,并可促进诱导的人牙髓干细胞向神经细胞分化,5%O_(2)促进人牙髓干细胞增殖、神经分化尤为显著。

关键词：人牙髓干细胞氧浓度增殖神经分化

miR-138-5p在微炎症环境中对人牙髓干细胞成牙本质向分化作用研究

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中国实用口腔科杂志 2023年第4期16卷 444-451页

作者：鄢晓媛张泽颖喻施文邱秋劲尉鹏功郭佳杰仇丽鸿中国医科大学口腔医学院·附属口腔医院牙体牙髓病科辽宁省口腔疾病重点实验室辽宁沈阳110002

目的研究miR-138-5p在微炎症环境对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)成牙本质向分化过程中的作用。方法研究于2021年5月至2022年3月在中国医科大学口腔医学院中心实验室进行。原代培养并分离细胞,通过流式细胞术检... 详细信息

目的研究miR-138-5p在微炎症环境对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)成牙本质向分化过程中的作用。方法研究于2021年5月至2022年3月在中国医科大学口腔医学院中心实验室进行。原代培养并分离细胞,通过流式细胞术检测细胞表面间充质干细胞表面标记分子CD29、CD105、CD146及造血干细胞表面标记分子CD14、CD45的细胞阳性率,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色鉴定是否为hDPSCs及其成骨分化能力。根据ALP染色结果确定提高h DPSCs ALP活性的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)有效质量浓度,按照hDPSCs培养条件的不同分为生长培养液(GM)组(仅使用GM培养)、成牙本质向分化诱导培养液(OM)组(仅使用OM培养)、OM+LPS组(使用含有效质量浓度LPS的OM培养)。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组hDPSCs白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、成牙本质向分化相关指标[牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1,DMP1)]及miR-138-5p的表达差异。将上述3组分别分为敲减miRNA阴性对照小干扰RNA(以下简称“NC”)亚组及敲减miR-138-5p小干扰RNA(以下简称“i-138”)亚组,通过qRT-PCR检测各亚组的成牙本质向分化相关指标,以及通过ALP染色检测敲减miR-138-5p后对微炎症环境中hDPSCs成牙本质向分化的影响。结果分离出的原代细胞中表达间充质干细胞表面标记分子CD29、CD105的细胞阳性率超过95%,表达CD146的细胞阳性率超过30%,而表达造血干细胞表面标记分子CD14、CD45的细胞阳性率低于2%,且OM培养下细胞的ALP染色强于GM。ALP染色结果显示,含有0.01μg/mL质量浓度LPS的OM能有效促进hDPSCs成牙本质向分化。qRTPCR结果显示,OM+LPS组IL-6和TNF-α相对表达量均高于OM组,差异均有统计学意义(均P 细胞培养7 d后,OM组DSPP、miR-138-5p相对表达量均显著高于GM组;细胞培养4、7 d后,OM组DMP1相对表达量显著高于GM组;细胞培养1、4、7 d后,OM+LPS组DSPP与DMP1相对表达量均显著高于OM组;细胞培养4、7 d后,OM+LPS组miR-138-5p相对表达量显著高于OM组,差异均有统计学意义(均P <0.001)。敲减miR-138-5p后,i-138 OM组和i-138 OM+LPS组分别与NC OM组和NC OM+LPS组相比,miR-138-5p、DSPP、DMP1相对表达量均减少,差异均有统计学意义(均P <0.001),且ALP染色强度均减弱。结论微炎症环境可促进hDPSCs的成牙本质向分化,miR-138-5p可能在此过程中对h DPSCs成牙本质向分化起促进作用。

关键词：微炎症微小RNA 人牙髓干细胞成牙本质向分化脂多糖