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产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2018年第6期40卷 514-517页

作者：陈长俊刘伟陈端端秦贵平林晓佳王海荣山东农业大学动物科技学院山东泰安271018

为建立产气荚膜梭菌α毒素的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法,本研究以抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体(MAb)为捕获抗体,抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体为检测抗体,建立了检测α毒素的DAS-ELISA。通过优化反应条件,建立标准曲线;... 详细信息

为建立产气荚膜梭菌α毒素的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法,本研究以抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体(MAb)为捕获抗体,抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体为检测抗体,建立了检测α毒素的DAS-ELISA。通过优化反应条件,建立标准曲线;并对建立的DAS-ELISA方法进行性能评价及初步应用。采用该方法测定产气荚膜梭菌α毒素的最低检测限为0.353倍的小鼠LD_(50),可定量范围为0.353~90.368倍小鼠LD_(50)。结果表明该DAS-ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可以用于大批量样品检测。初步应用结果显示:患产气荚膜梭菌病的兔群肠内容物中产气荚膜梭菌的α毒素水平显著高于健康兔群(p毒素的DAS-ELISA建立有助于畜禽产气荚膜梭菌病的诊断及研究。

关键词：产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA 兔产气荚膜梭菌病

产气荚膜梭菌α毒素突变体构建及其卵黄抗体制备

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军事医学 2013年第9期37卷 671-675页

作者：李箐辛文文康琳高姗王景林安徽医科大学研究生院安徽230032 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的制备特异性的产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin,CPA)卵黄抗体(yolk immunoglobulin,IgY)。方法利用定点突变技术,将CPA第56位天冬氨酸和第68位组氨酸分别突变为丝氨酸,构建了重组表达载体pTIG-mCPAD56S和pTIG-mCPAH68S,将其转化入*** Origami中进行诱导表达。用亲和层析的方法对突变体蛋白进行纯化并对其活性及抗原性进行检测,将获得的突变体蛋白分别免疫健康母鸡,收集鸡蛋;经水稀释法纯化卵黄中IgY;用酶联免疫吸附试验检测IgY效价;通过筛选保护剂而选择最佳的IgY冻干条件。结果与结论pTIG-mCPA在Origami表达菌株中得到高效表达,经验证,mCPAD56S和mCPAH68S均完全失去生物学活性同时保留抗原性;纯化卵黄后得到较高纯度的特异性IgY,其效价可达到1∶200 000;经过IgY冻干条件的筛选,最终选择不添加保护剂大量冻干IgY作为抗体的储备。该研究为研制基于IgY抗体的检测方法奠定了基础。

关键词：产气荚膜梭菌α毒素突变 IgY 重组表达

产气荚膜梭菌α毒素C末端的三拷贝串联表达与免疫原性分析

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中国畜牧兽医 2018年第11期45卷 3237-3245页

作者：杜吉革刘莹朱真薛麒张秀坤李启红印春生康凯姚文生陈小云中国兽医药品监察所北京100081

本研究旨在获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)C末端(第247-370位氨基酸,CPA_C)三拷贝串联融合蛋白,并评价其免疫原性。对已知的A型产气荚膜梭菌CPAC编码基因(GenBank登录号:AY823400.1)进行优化设计,以同向串连的方式串联成三拷贝基因(GCPA_(... 详细信息

本研究旨在获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)C末端(第247-370位氨基酸,CPA_C)三拷贝串联融合蛋白,并评价其免疫原性。对已知的A型产气荚膜梭菌CPAC编码基因(GenBank登录号:AY823400.1)进行优化设计,以同向串连的方式串联成三拷贝基因(GCPA_(C3)),片段之间用柔性氨基酸linker(GGGS)连接,经人工合成后克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,获得CPA_C的三拷贝重组蛋白(rCPA_(C3))。利用Western blotting方法检测rCPA_(C3)与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。将rCPA_(C3)与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,免疫4只健康家兔,检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。在二免21d后,对家兔经耳缘静脉注射1个家兔最低致死剂量(MLD)的A型产气荚膜梭菌毒素,检测rCPA_(C3)对家兔的免疫保护效果。结果显示,rCPA_(C3)主要以包涵体的形式表达,且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应;每毫升的一免抗血清可中和30～50个、二免抗血清可中和70～100个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌毒素。采用1个家兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔100%(4/4)死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,rCPA_(C3)具有良好的免疫原性,为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的试验数据。

关键词：产气荚膜梭菌α毒素 C末端串联表达抗原性

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产气荚膜梭菌α毒素的原核表达及纯化

中国生物制品学杂志 2014年第10期27卷 1258-1262页

作者：于佳张国利陈萍田园岳玉环吴广谋何苗史飞孙诗雯吉林农业大学食品科学与工程学院吉林长春130118 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130122 吉林省人兽共患预防与控制重点实验室省部共建重点实验室吉林长春130122

目的克隆产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin,CPA)全基因,在大肠埃希菌(***)中表达并纯化α毒素。方法设计并合成CPA的全基因,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28aCPA,转化*** BL21(DE3),IPTG诱导... 详细信息

目的克隆产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin,CPA)全基因,在大肠埃希菌(***)中表达并纯化α毒素。方法设计并合成CPA的全基因,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28aCPA,转化*** BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化表达条件,并对重组蛋白进行纯化。结果双酶切和测序鉴定结果表明,CPA基因以正确的阅读框架克隆入pET-28a载体中;表达的重组蛋白相对分子质量约为43 000,主要以可溶性形式表达,最佳培养基为TB培养基,最佳诱导温度为37℃,诱导时间为3 h;纯化的重组蛋白纯度达95%以上,浓度为0.663 mg/ml,收率为5 mg/g湿菌。结论成功在***中表达了CPA,纯化后的CPA纯度较高,为进一步研究其结构、功能、致病机制及制备抗α毒素人源单链抗体奠定了基础。

关键词：产气荚膜梭菌α毒素基因克隆原核细胞基因表达纯化

产气荚膜梭菌α毒素C末端的二拷贝串联表达与免疫原性分析

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中国兽医杂志 2019年第1期55卷 7-10页

作者：杜吉革王磊薛麒朱真李启红印春生姚文生康凯陈小云中国兽医药品监察所北京海淀100081

本研究旨在获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)C末端(第247-370位氨基酸,CPA_C)二拷贝串联融合蛋白,并评价其免疫原性。对已知的A型产气荚膜梭菌CPA_C编码基因进行优化设计,将其以同向串连的方式串联成二拷贝基因(GCPA_(C2)),经人工合成获得... 详细信息

本研究旨在获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)C末端(第247-370位氨基酸,CPA_C)二拷贝串联融合蛋白,并评价其免疫原性。对已知的A型产气荚膜梭菌CPA_C编码基因进行优化设计,将其以同向串连的方式串联成二拷贝基因(GCPA_(C2)),经人工合成获得基因片段GCPA_(C2)。将GCPA_(C2)克隆至原核表达载体pET-30a (+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rCPA_(C2)。利用Western Blot方法检测rCPA_(C2)与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。随后,用rCPA_(C2)免疫家兔,并检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。在二免21 d后,经耳缘静脉注射1个家兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素,检测rCPA_(C2)对家兔的免疫保护效果。结果表明,rCPA_(C2)主要以包涵体的形式表达且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。每毫升的一免和二免抗血清分别可中和30个和80个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌毒素。1个兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,rCPA_(C2)具有良好的免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的实验数据。

关键词：产气荚膜梭菌α毒素 C末端串联表达抗原性

产气荚膜梭菌α毒素表达、纯化及人源scFv抗体筛选

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产气荚膜梭菌α毒素表达、纯化及人源scFv抗体筛选

作者：于佳吉林农业大学

学位级别：硕士

产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin,CPA)是引起人类食物中毒和气性坏疽的主要致病外毒素,广泛的存在于自然界中。近年来,出现了越来越多由产气荚膜梭菌引起的食物中毒事件,而且其主要的致病因子是CPA,人们开始从... 详细信息

产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin,CPA)是引起人类食物中毒和气性坏疽的主要致病外毒素,广泛的存在于自然界中。近年来,出现了越来越多由产气荚膜梭菌引起的食物中毒事件,而且其主要的致病因子是CPA,人们开始从各个方面研究CPA的性质,主要有CPA的结构、N端和C端的功能以及基因融合表达等,但对CPA引起食物中毒后的急性救治与治疗性抗体,目前并没有深入的研究。本研究利用基因工程手段,将CPA全基因序列的两端插入Nde I和EcoR I酶切位点,构建重组表达质粒pET-28a-CPA,制备感受态*** BL21(DE3)细胞,获得表达菌*** BL21(DE3)(pET-28a-CPA),对诱导表达条件进行优化,摸索纯化工艺获得最佳纯化条件,最终得到纯度高的CPA纯品。以CPA为抗原,通过Tomlinson I+J全人源噬菌体抗体库,筛选人源抗CPA-scFv,单链抗体经诱导表达以及纯化后测定单链抗体的免疫结合活性、生物学活性和亲和常数。重组表达质粒pET-28a-CPA,经双酶切鉴定正确后,经测序得出结果显示:CPA全基因以正确的阅读框架克隆入pET-28a载体中,表达的重组蛋白相对分子质量约为43000 Da。对表达条件和纯化工艺进行优化后,CPA主要以可溶性形式表达,最佳诱导条件为:TB培养基,诱导温度为37℃,诱导时间为3 h;最佳纯化工艺为:样品经30%-50%饱和度硫酸铵沉淀—疏水层析(Butyl Sepharose 4 FF)—金属螯合层析(Cu2+)—阴离子交换层析(DEAE)—酶切后的经金属螯合层析(Cu2+),获得纯度为95.53%的CPA,浓度为0.663 mg/mL,蛋白回收率为5 mg/g湿菌。通过四轮筛选后,鉴定得到两株阳性克隆scFv-7D和scFv-8B,经DNA测序和Blast数据库分析后均为人源单链抗体。获得的阳性菌株诱导表达,经过60%饱和度硫酸铵沉淀—rProtein-A FF亲和层析后,能够获得的纯度在90%以上的单链抗体;生物活性试验结果显示:scFv-8B和scFv-7D都具有良好的抑制CPA活性的作用;通过间接法ELISA测定免疫结合活性,得出scFv-8B的免疫结合活性高于scFv-7D,且scFv免疫结合活性强度与scFv的浓度呈正向相关;测定scFv亲和常数:scFv-7D为(2.01±0.78)×108 L/mol,scFv-8B为(3.45±0.58)×108 L/mol。在本研究中,CPA在大肠杆菌中以可溶形式表达,在以特定纯化工艺后,获得纯度较高的CPA,操作简便,且回收率高,为蛋白纯化开辟了一条新的途径,也对进一步研究C PA在食物中毒中的致病机制和生物学特性有重大意义。同时成功筛选出的人源抗CPA-sc Fv,具有较强的生物学活性和免疫结合活性,也有利于治疗与预防CPA引起的食物中毒,在以后应用中能够避免人体产生人抗鼠抗体反应,减少了副作用,提高了安全性和有效性,为其他细菌性食物中毒的救治提供了新方法。

关键词：产气荚膜梭菌α毒素基因克隆表达纯化单链抗体

产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

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产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

作者：孙佳芝山东农业大学

学位级别：硕士

产气荚膜梭菌易引发畜禽产气荚膜梭菌病，此类病的发病急、死亡率高，给各国畜牧业带来巨大经济损失，且易引起人食物中毒和气性坏疽，严重影响人们身体健康，因此对产气荚膜梭菌病的快速诊断尤为重要。各型产气荚膜梭菌均产生α毒素，... 详细信息

产气荚膜梭菌易引发畜禽产气荚膜梭菌病，此类病的发病急、死亡率高，给各国畜牧业带来巨大经济损失，且易引起人食物中毒和气性坏疽，严重影响人们身体健康，因此对产气荚膜梭菌病的快速诊断尤为重要。各型产气荚膜梭菌均产生α毒素，它具有细胞毒性、溶血活性、致死性和皮肤坏死性等特性，因此α毒素是诊断产气荚膜梭菌病的重要指标，为了对其进行快速、有效检测，必须建立准确、高效、特异的α毒素检测技术。本研究以产气荚膜梭菌α毒素为检测对象，以抗α毒素单克隆抗体、多克隆抗体为基础，建立了双抗体夹心ELISA(Double Antibody Sandwich ELISA, DAS-ELISA)方法，为α毒素定量监测、后续研究提供有效工具和基础。将α毒素重组质粒经酶切、测序验证后，摸索IPTG最佳诱导条件，表达出大量包涵体重组α毒素蛋白，经Ni-changed Resin镍柱纯化后运用SDS-PAGE、Western Blot验证，免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，运用饱和硫酸铵法纯化，并检测其效价和特异性;免疫BALB/c小鼠，制备单克隆抗体，正辛酸法纯化后，鉴定其特异性、反应原性、中和活性等。通过方针滴定试验选取最佳抗体配对建立DAS-ELISA方法，对方法反应条件进行优化。将重组的α毒素蛋白标准品从1500ng/mL起两倍系列稀释至0.73ng/mL，检测后建立标准曲线;并对建立的DAS-ELISA方法进行性能评价。DAS-ELISA方法对α毒素的有效检测范围为5.8675ng/mL，最低检测限为4.57ng/mL;精密度分析表明批间和批内变异系数均小于10%，说明该方法具有较好的重复性和稳定性;回收率测定结果在97.22%02.85%范围内，表明该方法准确性较高;特异性试验表明本方法与β毒素、ε毒素等无关蛋白无交叉反应，而与天然α毒素和重组α毒素蛋白有特异性反应，说明本法具有较高的特异性。本方法的初步应用结果显示，相同培养条件下，A型产气荚膜梭菌标准菌株的培养上清中，α毒素含量差异较大，A型菌(NCTC8237)中α毒素含量显著高于其他菌型;国外检测试剂盒检测后可得出α毒素的相同变化趋势，但是其无法定量检测;本方法比多抗-多抗双夹心ELISA有更高的特异性和敏感性;检测临床发病兔子肠内容物，结果与兔魏氏梭菌病临床病理变化典型程度相对应，病变越明显的兔子，测得的OD值越高。本研究成功制备了高特异性的单克隆抗体，并建立了特异、灵敏、稳定的DAS-ELISA方法，可以检测α毒素外源表达蛋白、培养上清及临床样品中的天然毒素，并能得到准确的检测结果，为高效检测α毒素提供了有效工具。本法可用于大批量样品检测、α毒素的初步定量和结果的快速获得，为畜禽产气荚膜梭菌病的诊断及研究提供了更快速、有效的工具，并为疫苗质量和食品安全监测的研究奠定了坚实的基础。

关键词：产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体单克隆抗体双抗体夹心ELISA 初步应用

产气荚膜梭菌α毒素C末端与中和抗原表位的串联表达及免疫保护性分析

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中国兽药杂志 2018年第8期52卷 1-6页

作者：杜吉革薛麒朱真彭小兵张秀坤李启红印春生姚文生康凯陈小云中国兽医药品监察所北京100081

为获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)的C末端(CPAC)与中和抗原表位NE(ARGFAK)的串联融合蛋白并评价其免疫原性,对已知的A型产气荚膜梭菌CPAC及NE的编码基因进行优化设计,并将两个基因的三拷贝序列串联,经人工合成获得基因片段GCPAC3NE3。将... 详细信息

为获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)的C末端(CPAC)与中和抗原表位NE(ARGFAK)的串联融合蛋白并评价其免疫原性,对已知的A型产气荚膜梭菌CPAC及NE的编码基因进行优化设计,并将两个基因的三拷贝序列串联,经人工合成获得基因片段GCPAC3NE3。将该片段克隆至原核表达载体p ET30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白。利用Western blot方法检测重组蛋白与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。随后,以纯化的重组蛋白免疫家兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测家兔血清的中和抗体效价。在二免后21 d,以1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素对家兔进行攻毒。结果表明重组蛋白主要以包涵体的形式存在表达且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。每毫升的一免抗血清可中和40个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和80个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,重组蛋白具有良好的免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的实验数据。

关键词：产气荚膜梭菌α毒素 C末端中和抗原表位串联表达抗原性

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产气荚膜梭菌α毒素分子生物学研究进展

生物技术通讯 2013年第1期24卷 113-117页

作者：张艳平唐成程许崇波大连大学生命科学与技术学院辽宁大连116622 吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062 大连大学医学院辽宁大连116622

α毒素是产气荚膜梭菌主要的毒力因子,具有磷脂酶C和鞘磷脂酶等2种酶的活性,能同时水解细胞膜上的磷脂酰胆碱和鞘磷脂,导致细胞裂解,因而具有细胞毒性、溶血活性、致死性和血小板聚集等特性。我们对产气荚膜梭菌α毒素的生物学特性、基... 详细信息

α毒素是产气荚膜梭菌主要的毒力因子,具有磷脂酶C和鞘磷脂酶等2种酶的活性,能同时水解细胞膜上的磷脂酰胆碱和鞘磷脂,导致细胞裂解,因而具有细胞毒性、溶血活性、致死性和血小板聚集等特性。我们对产气荚膜梭菌α毒素的生物学特性、基因克隆与转录调控、基因表达与基因融合、基因定点突变与结构分析、N端和C端的结构与功能等方面的研究进展进行简要综述。

关键词：产气荚膜梭菌α毒素转录调控基因表达定点突变结构与功能