产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

作     者：孙佳芝 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王海荣;柴同杰

授予年度：2014年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：产气荚膜梭菌α毒素 多克隆抗体 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA 初步应用 

摘      要：产气荚膜梭菌易引发畜禽产气荚膜梭菌病，此类病的发病急、死亡率高，给各国畜牧业带来巨大经济损失，且易引起人食物中毒和气性坏疽，严重影响人们身体健康，因此对产气荚膜梭菌病的快速诊断尤为重要。各型产气荚膜梭菌均产生α毒素，它具有细胞毒性、溶血活性、致死性和皮肤坏死性等特性，因此α毒素是诊断产气荚膜梭菌病的重要指标，为了对其进行快速、有效检测，必须建立准确、高效、特异的α毒素检测技术。 本研究以产气荚膜梭菌α毒素为检测对象，以抗α毒素单克隆抗体、多克隆抗体为基础，建立了双抗体夹心ELISA(Double Antibody Sandwich ELISA, DAS-ELISA)方法，为α毒素定量监测、后续研究提供有效工具和基础。 将α毒素重组质粒经酶切、测序验证后，摸索IPTG最佳诱导条件，表达出大量包涵体重组α毒素蛋白，经Ni-changed Resin镍柱纯化后运用SDS-PAGE、Western Blot验证，免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，运用饱和硫酸铵法纯化，并检测其效价和特异性;免疫BALB/c小鼠，制备单克隆抗体，正辛酸法纯化后，鉴定其特异性、反应原性、中和活性等。通过方针滴定试验选取最佳抗体配对建立DAS-ELISA方法，对方法反应条件进行优化。 将重组的α毒素蛋白标准品从1500ng/mL起两倍系列稀释至0.73ng/mL，检测后建立标准曲线;并对建立的DAS-ELISA方法进行性能评价。DAS-ELISA方法对α毒素的有效检测范围为5.8675ng/mL，最低检测限为4.57ng/mL;精密度分析表明批间和批内变异系数均小于10%，说明该方法具有较好的重复性和稳定性;回收率测定结果在97.22%02.85%范围内，表明该方法准确性较高;特异性试验表明本方法与β毒素、ε毒素等无关蛋白无交叉反应，而与天然α毒素和重组α毒素蛋白有特异性反应，说明本法具有较高的特异性。 本方法的初步应用结果显示，相同培养条件下，A型产气荚膜梭菌标准菌株的培养上清中，α毒素含量差异较大，A型菌(NCTC8237)中α毒素含量显著高于其他菌型;国外检测试剂盒检测后可得出α毒素的相同变化趋势，但是其无法定量检测;本方法比多抗-多抗双夹心ELISA有更高的特异性和敏感性;检测临床发病兔子肠内容物，结果与兔魏氏梭菌病临床病理变化典型程度相对应，病变越明显的兔子，测得的OD值越高。 本研究成功制备了高特异性的单克隆抗体，并建立了特异、灵敏、稳定的DAS-ELISA方法，可以检测α毒素外源表达蛋白、培养上清及临床样品中的天然毒素，并能得到准确的检测结果，为高效检测α毒素提供了有效工具。本法可用于大批量样品检测、α毒素的初步定量和结果的快速获得，为畜禽产气荚膜梭菌病的诊断及研究提供了更快速、有效的工具，并为疫苗质量和食品安全监测的研究奠定了坚实的基础。