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PDCoV和PEAV二重rt-pcr检测方法的建立及初步应用

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中国兽医科学 2020年第2期50卷 141-146页

作者：黄海鑫宋心玥汪伟李笨王茂鹏肖朋朋郑敏金宁一孙文超鲁会军温州大学病毒学研究所浙江温州325035 军事科学院军事兽医研究所吉林长春130122 广西动物疫病预防控制中心广西南宁530004

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪肠道α冠状病毒(PEAV)是两种新发现的猪传染性冠状病毒,临床上均以腹泻症状为主,症状相似,临床上难以快速诊断。为建立一种快速、准确区分PDCoV和PEAV的二重rt-pcr方法,本研究根据PDCoV和PEAV N基因序列,分... 详细信息

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪肠道α冠状病毒(PEAV)是两种新发现的猪传染性冠状病毒,临床上均以腹泻症状为主,症状相似,临床上难以快速诊断。为建立一种快速、准确区分PDCoV和PEAV的二重rt-pcr方法,本研究根据PDCoV和PEAV N基因序列,分别设计2对特异性引物,以阳性质粒为模板,对二重rt-pcr反应条件进行优化,并进行特异性、敏感性试验。结果显示,所建立的方法能够扩增出PDCoV和PEAV的特异性片段,大小分别为690 bp和208 bp,且对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)无扩增条带;对PDCoV和PEAV的最低检测量分别为5.13×102copies/μL、4.73×101copies/μL。对60份临床腹泻样本病料进行检测,结果PDCoV的检出率为21.6%,未检测出PEAV。本研究所建立的二重rt-pcr方法可用于临床流行病学监测,为快速诊断PDCoV和PEAV提供理论依据和技术支持。

关键词：猪德尔塔冠状病毒猪肠道α冠状病毒二重rt-pcr

猪流行性腹泻病毒与猪伪狂犬病病毒二重rt-pcr检测方法的建立及应用

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中国畜牧兽医 2016年第9期43卷 2455-2460页

作者：孙彦琴马震原闫若潜王东方曹伟伟郭育培河南省动物卫生监督所郑州450008 河南省动物疫病预防控制中心郑州450008

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)与猪伪狂犬病病毒(PRV)的快速鉴别检测方法,本研究根据GenBank已登录的PEDV膜蛋白M基因和PRVgE基因保守区域序列设计了2对特异性引物,以PRV和PEDV混合总RNA为反转录模板,初步建立了PRV和PEDV的二重rt-pcr... 详细信息

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)与猪伪狂犬病病毒(PRV)的快速鉴别检测方法,本研究根据GenBank已登录的PEDV膜蛋白M基因和PRVgE基因保守区域序列设计了2对特异性引物,以PRV和PEDV混合总RNA为反转录模板,初步建立了PRV和PEDV的二重rt-pcr检测方法,并进行了特异性、敏感性、重复性验证和临床应用检测。结果显示,该方法对两种病毒的最低检测限均为10TCID50/mL病毒含量,重复性好,特异性强,可特异性地扩增PEDV和PRV细胞培养物,但对其他7种病原对照扩增不出任何条带,对26份临床疑似PEDV和PRV感染样品检测结果与测序鉴定结果完全一致。本研究成功建立了PEDV和PRV的二重rt-pcr检测方法,为临床上猪流行性腹泻和猪伪狂犬病的快速鉴别诊断提供了方法。

关键词：猪流行性腹泻病毒猪伪狂犬病病毒二重rt-pcr

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鉴别猪瘟野毒与疫苗毒的单一与二重rt-pcr检测方法的建立及应用

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中国畜牧兽医 2016年第9期43卷 2230-2239页

作者：马萍李达汤德元张元鑫张华曾智勇刘霞韦冠东贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州省动物疫病预防控制中心贵阳550008

为建立一种对猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)临床样本快速、简便的检测技术,以区分猪瘟(classical swine fever,CSF)野毒和疫苗毒感染,为规模化猪场CSF净化奠定基础。通过对GenBank中CSF野毒、疫苗毒及近源病毒的基因组全... 详细信息

为建立一种对猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)临床样本快速、简便的检测技术,以区分猪瘟(classical swine fever,CSF)野毒和疫苗毒感染,为规模化猪场CSF净化奠定基础。通过对GenBank中CSF野毒、疫苗毒及近源病毒的基因组全序列比对,发现CSF兔化弱毒疫苗株3′-NTR独立存在富含T的插入序列,根据这一特点分别在该插入序列的上、下两端设计2对单一rt-pcr引物并选择特异保守区域设计了二重rt-pcr引物,优化筛选能够鉴别CSF野毒与兔化弱毒疫苗的pcr反应条件,建立了能鉴别CSF野毒和疫苗毒的单一与二重rt-pcr鉴别诊断方法。敏感性和特异性分析表明,单一rt-pcr检测CSFV各引物最低核酸检测量分别为2.2pg(单一rt-pcr中的1对引物)和1.7pg(单一rt-pcr中的另外1对引物);二重rt-pcr检测CSFV各引物最低核酸检测量分别为8.2pg(CSF野毒)和6.7pg(CSF疫苗毒),两种方法均检测不到PRV、PRRSV、JEV、BVDV、PCV2的DNA/RNA。采用该方法对146份可疑临床样品进行检测,结果表明CSF疫苗毒与野毒在能繁母猪、育肥猪、保育猪和哺乳仔猪中的二重感染率分别为6.3%、7.4%、8.3%、8.6%。本研究建立的单一与二重rt-pcr方法都具有敏感性强、特异性优、重复性好的特点,该研究对规模化猪场猪瘟的净化具有十分重要的参考价值。

关键词：猪瘟病毒野毒疫苗毒单一rt-pcr 二重rt-pcr 鉴别诊断净化应用

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猪传染性胃肠炎与流行性腹泻病毒二重rt-pcr检测方法的建立及应用

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中国畜牧兽医 2012年第9期39卷 38-42页

作者：闫若潜安春霞刘淑敏赵雪丽郭小玲赵明军吴志明河南省动物疫病预防控制中心河南郑州450008 郑州市中心医院消毒供应中心河南郑州450007 河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与流行性腹泻病毒(PEDV)的快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的TGEV核蛋白(N)基因和PEDV膜蛋白(M)基因保守区域序列分别设计了1对特异性引物,以TGEV和PEDV混合总RNA为反转录模板,建立了TGEV和PED... 详细信息

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与流行性腹泻病毒(PEDV)的快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的TGEV核蛋白(N)基因和PEDV膜蛋白(M)基因保守区域序列分别设计了1对特异性引物,以TGEV和PEDV混合总RNA为反转录模板,建立了TGEV和PEDV的二重rt-pcr检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了应用检测,并对检测到的阳性样品进行克隆测序。结果表明,成功建立了TGEV和PEDV二重rt-pcr检测方法,该方法的检测灵敏度最低极限为10TCID50/mL病毒含量,重复性好,特异性强,可特异性地扩增TGEV和PEDV细胞培养物,但对ST细胞和其他7种病原对照扩增不出任何条带;对22份临床疑似TGEV和PEDV感染样品检测结果与测序结果完全一致。本研究成功建立了TGEV与PEDV二重rt-pcr检测方法,可适用于猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病的快速鉴别诊断。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒猪流行性腹泻病毒二重rt-pcr 检测建立应用

鸭坦布苏病毒与鸭圆环病毒二重rt-pcr方法的建立

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黑龙江畜牧兽医 2014年第12期 44-47页

作者：张艳芳谢芝勋谢丽基刘加波范晴庞耀珊邓显文谢志勤罗思思广西壮族自治区兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室南宁530001

为了研究一种可同时检测鸭坦布苏病毒与鸭圆环病毒的二重pcr方法,试验采用DNASTAR及Primer Premier 5.0软件,针对Gen Bank中坦布苏病毒(DTMUV)E基因和鸭圆环病毒(Du CV)REP基因的保守序列,设计合成了2对引物,通过优化反应体系条件及特... 详细信息

为了研究一种可同时检测鸭坦布苏病毒与鸭圆环病毒的二重pcr方法,试验采用DNASTAR及Primer Premier 5.0软件,针对Gen Bank中坦布苏病毒(DTMUV)E基因和鸭圆环病毒(Du CV)REP基因的保守序列,设计合成了2对引物,通过优化反应体系条件及特异性、敏感性评价,建立了鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的二重rt-pcr方法。结果表明:该方法对鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的检测敏感性达到100 fg;使用该方法对新城疫病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、番鸭呼肠孤病毒、H9亚型禽流感病毒和减蛋综合征病毒的检测结果全为阴性。说明建立的二重rt-pcr检测方法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒感染的快速鉴别诊断。

关键词：鸭坦布苏病毒鸭圆环病毒二重rt-pcr 方法建立

牛病毒性腹泻病毒基因分型二重rt-pcr检测方法的建立

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中国兽医杂志 2017年第7期53卷 20-23页

作者：崔元王建昌王金凤袁万哲河北农业大学动物医学院河北保定071001 河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心河北石家庄050051 河北省兽医生物技术工程技术研究中心河北保定071001

为了同步检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因1型和基因2型并能够加以区分,根据Gen Bank中已发表的BVDV基因1型和基因2型、牛蓝舌病病毒(BTV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的全基因序列,采用Primer Premi... 详细信息

为了同步检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因1型和基因2型并能够加以区分,根据Gen Bank中已发表的BVDV基因1型和基因2型、牛蓝舌病病毒(BTV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的全基因序列,采用Primer Premier 5.0软件,针对BVDV的高度保守的5'端非编码区的核苷酸序列,设计了两对特异性引物,二重rt-pcr方法扩增目的片段的大小分别为222 bp和119 bp,经过对反应体系和条件的优化,本研究建立了在同一反应体系中鉴别检测BVDV基因1型和2型的rt-pcr方法,扩增出了与预期大小相符的目的片段。该方法便捷,特异性高,敏感性强,重复性好,可作为BVDV分型鉴定和快速诊断的有效方法。

关键词： BVDV 二重rt-pcr 基因性

H3N2亚型禽流感病毒二重rt-pcr检测方法的建立

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黑龙江畜牧兽医 2015年第7期 172-174页

作者：刘婷婷谢芝勋宋德贵罗思思谢丽基李孟谢志勤邓显文广西师范大学生命科学学院广西桂林541000 广西兽医研究所畜禽疫苗新技术重点实验室南宁530001

为了建立一种简便、快速检测H3N2亚型禽流感病毒的方法,试验根据Gen Bank中H3、N2亚型禽流感病毒HA和NA基因保守序列,设计并筛选出2对特异性引物,通过优化反应条件建立H3N2亚型禽流感病毒二重rt-pcr检测方法。结果表明:该方法既能同时... 详细信息

为了建立一种简便、快速检测H3N2亚型禽流感病毒的方法,试验根据Gen Bank中H3、N2亚型禽流感病毒HA和NA基因保守序列,设计并筛选出2对特异性引物,通过优化反应条件建立H3N2亚型禽流感病毒二重rt-pcr检测方法。结果表明:该方法既能同时特异性扩增出H3N2亚型禽流感病毒,也可扩增出H3、N2亚型禽流感病毒,而对其他亚型和常见禽病病原体均不扩增;该方法对H3N2亚型禽流感病毒的检测下限为10 pg;用该方法对96份临床样品进行检测,结果与病毒分离鉴定结果一致。说明试验所建立的H3N2亚型禽流感病毒二重rt-pcr检测方法具有特异性强、灵敏度高的特点。

关键词： H3N2亚型禽流感病毒二重rt-pcr 病毒分离特异性敏感性检测技术

猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二重rt-pcr检测方法的建立及应用

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黑龙江畜牧兽医 2018年第19期 126-129页

作者：董波安永帅李静楠戴爱玲李晓华杨小燕龙岩学院生命科学学院福建龙岩364012 福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室福建龙岩364012

为了建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的快速鉴别诊断方法,试验根据GenBank中已发表的PEDV和TGEV的相关基因序列,设计合成特异性引物,分别进行单项pcr最佳反应条件的摸索;确定最佳反应条件后建立PEDV和TGEV的... 详细信息

为了建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的快速鉴别诊断方法,试验根据GenBank中已发表的PEDV和TGEV的相关基因序列,设计合成特异性引物,分别进行单项pcr最佳反应条件的摸索;确定最佳反应条件后建立PEDV和TGEV的二重rt-pcr检测方法,并进行特异性分析;同时采用单项rt-pcr和二重rt-pcr法检测临床样本,比较两种方法的检出率。结果表明：试验成功建立了PEDV和TGEV的二重rt-pcr检测方法,经最佳退火温度摸索,二重rt-pcr法的最佳退火温度为58.1℃;经特异性分析,二重rt-pcr法对PEDV和TGEV具有很好的特异性;临床样本的检测结果显示,二重rt-pcr法与单项rt-pcr法检出率基本吻合。说明试验建立的PEDV和TGEV的二重rt-pcr检测方法可用于猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻病的快速鉴别诊断。

关键词：猪流行性腹泻病毒猪传染性胃肠炎病毒二重rt-pcr 检测建立应用

鸭坦布苏病毒与鸭瘟病毒二重rt-pcr检测方法的建立

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南方农业学报 2014年第2期45卷 314-317页

作者：张艳芳谢芝勋谢丽基刘加波庞耀珊邓显文谢志勤范晴罗思思广西兽医研究所/广西畜禽疫苗新技术重点实验室南宁530001

【目的】建立可同时检测鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)与鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)的二重rt-pcr,为有效防控DTMUV与DPV提供技术支撑。【方法】根据GenBank中DTMUV E基因和DPV UL6基因的保守序列,设计合成两对引物,优... 详细信息

【目的】建立可同时检测鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)与鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)的二重rt-pcr,为有效防控DTMUV与DPV提供技术支撑。【方法】根据GenBank中DTMUV E基因和DPV UL6基因的保守序列,设计合成两对引物,优化反应体系条件,并通过特异性、敏感性试验评价建立的二重rt-pcr。【结果】优化后的二重rt-pcr反应体系为:2×pcr Mix 12.5μL,其中DTMUV上、下引物各0.5μL,DPV上、下引物各0.5μL,混合模板2.0μL,ddH2O补足至25.0μL;最佳反应程序:95℃预变性5 min;95℃1 min,54.4℃1 min,72℃1 min,进行35个循环;72℃延伸10 min。该方法对DTMUV与DPV的检测敏感性分别达500和600 fg,但对鸭源新城疫病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、H9亚型禽流感病毒和减蛋综合症病毒等病原体不敏感。【结论】建立的二重rt-pcr可用于DTMUV与DPV感染的快速鉴别诊断。

关键词：鸭坦布苏病毒鸭瘟病毒二重rt-pcr 特异性敏感性