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环境水体中霍乱弧菌的二次pcr检测方法

环境与健康杂志 2012年第7期29卷 643-645页

作者：黄海周登仁王琼妹邝仕壮庞燕海口市疾病预防控制中心微生物检验科海南571100

目的建立环境水体中霍乱弧菌的二次pcr检测方法。方法对霍乱弧菌的外环境水监测样本进行pcr检测;确定弱电泳条带或无电泳条带的稀释度,将第一次pcr的产物梯度稀释后进行二次pcr。采用琼脂凝胶糖电泳进行分析。结果对378件环境水样分别... 详细信息

目的建立环境水体中霍乱弧菌的二次pcr检测方法。方法对霍乱弧菌的外环境水监测样本进行pcr检测;确定弱电泳条带或无电泳条带的稀释度,将第一次pcr的产物梯度稀释后进行二次pcr。采用琼脂凝胶糖电泳进行分析。结果对378件环境水样分别进行一次、二次pcr检测,有4件水样经两种方法检测均为阳性,有6件水样二次pcr检测为阳性。一次pcr检测霍乱弧菌的阳性率[1.06%(4/378)]低于二次pcr[2.65%(10/378)],差异有统计学意义(P二次pcr操作简便快速、检出率高、费用低廉,适用于环境水样中霍乱弧菌的快速监测。

关键词：二次pcr 水霍乱弧菌

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二次pcr在临床上的应用

中国优生与遗传杂志 2000年第6期8卷 40-40,51页

作者：陈鑫苹符生苗海南省人民医院海口570311

文章应用二次pcr对结核杆菌 (TB)、淋球菌 (NG)、沙眼衣原体 (CT)、解脲支原体 (UU)、人乳头状瘤病毒(HPV)进行检测。结果表明二次pcr的敏感性明显高于一次pcr ,适用于科研和临床 ,尤其适用于被扩增量少的标本。

关键词：二次pcr 敏感性宫颈分泌物检测

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二次pcr在临床上的应用

陕西医学检验 1996年第1期11卷 12-13页

作者：朱美玲深圳宝安西乡人民医院检验科 518102

对临床待检标本进行二次pcr扩增，结果显示：使用不同厂家的试剂盒来进行二次pcr扩增，敏感度均高于第一次扩增效果，尤其对于含靶基因少的标本，如检测脑脊液、血液中的结核杆菌，慢性淋病奈瑟氏菌感染的患者，其阳性率均是第一次pcr... 详细信息

对临床待检标本进行二次pcr扩增，结果显示：使用不同厂家的试剂盒来进行二次pcr扩增，敏感度均高于第一次扩增效果，尤其对于含靶基因少的标本，如检测脑脊液、血液中的结核杆菌，慢性淋病奈瑟氏菌感染的患者，其阳性率均是第一次pcr扩增结果的2．33、3倍，并且特异性不受影响。

关键词：二次pcr 聚合酶链反应临床应用

多重二次pcr在微量DNA标本检验中的应用

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广西医科大学学报 2002年第6期19卷 799-800页

作者：张海添陆云飞李卫曾健廖清华林伟雄陈剑锋金琪广西医科大学第一附属医院胃肠腺体外科南宁530021 广西医科大学第一附属医院儿科实验室南宁530021

目的 :探讨用多重二次 pcr扩增极微量 DNA标本供后续 SSCP和 DNA测序分析。方法 :对照组取微量组织提取的DNA为模板 ,分别用不同的 4对引物各自行 pcr,同一 pcr反应体系里加入 4对引物扩增。然后将此扩增产物稀释 10 0 0倍为模板 ,再以... 详细信息

目的 :探讨用多重二次 pcr扩增极微量 DNA标本供后续 SSCP和 DNA测序分析。方法 :对照组取微量组织提取的DNA为模板 ,分别用不同的 4对引物各自行 pcr,同一 pcr反应体系里加入 4对引物扩增。然后将此扩增产物稀释 10 0 0倍为模板 ,再以相同引物进行第二次 pcr。实验组 :取微量组织提取的 DNA为模板 ,以与对照组相同的 4对引物各自进行 pcr。用琼脂糖凝胶电泳检测 pcr结果 ,用 DNA测序方法检测二次 pcr扩增产物的特异性。结果 :微量的 DNA标本可同时被多对引物二次扩增。实验组与对照组比较 ,各自引物扩增的 DNA片段在琼脂糖凝胶电泳显示区带速率相同 ,测序显示碱基序列相同。结论 :因极微量的 DNA模板不能满足多引物多次 pcr时 ,可用多重二次 pcr扩增 ,本方法在法医学。

关键词：多重pcr 二次pcr DNA测序

人白介素24cDNA克隆、突变纠正和原核表达

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西安交通大学学报（医学版） 2007年第2期28卷 130-133页

作者：魏丽丽李成华袁成福陈济丁嵩涛刘革力易发平宋方洲重庆医科大学生物化学和分子生物学教研室重庆400016

目的获取人白介素24(IL-24)cDNA,构建原核表达载体以表达含有谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白GST-IL-24。方法以人外周血单核细胞(PBMC)总RNA为模板,RT-pcr扩增IL-24 cDNA,克隆入原核表达载体pGEX-4T-2,测序结果显示在IL-24 cDNA第223位... 详细信息

目的获取人白介素24(IL-24)cDNA,构建原核表达载体以表达含有谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白GST-IL-24。方法以人外周血单核细胞(PBMC)总RNA为模板,RT-pcr扩增IL-24 cDNA,克隆入原核表达载体pGEX-4T-2,测序结果显示在IL-24 cDNA第223位G→A,370位T→C,从而导致其编码蛋白的氨基酸发生改变:A75T,H124Y,通过二次pcr将其纠正,重组载体pGEX-IL-24转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基--βD-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE,Western blot检测显示有融合蛋白GST-IL-24表达。结果通过RT-pcr及二次pcr得到人IL-24 cDNA,构建其原核表达载体,经IPTG诱导在相对分子量约为50 000处有融合蛋白表达。结论IL-24的重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)可以表达GST-IL-24融合蛋白。

关键词：白介素24 二次pcr 突变纠正融合蛋白克隆原核表达

人白介素24融合载体的构建、突变纠正和表达优化

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广西师范大学学报（自然科学版） 2016年第1期34卷 150-155页

作者：范秋丽宋德贵广西师范大学生命科学学院广西桂林541006

以武汉大学病毒学国家重点实验室保存的白介素24(IL-24)为模板,构建原核表达载体pET28a-IL-24,转化大肠杆菌DH5α,挑取单克隆,测序结果显示:在IL-24第18位A→G,21位C→T,412位G→A,18位和21位的突变没有使该位上的氨基酸发生改变,而412... 详细信息

以武汉大学病毒学国家重点实验室保存的白介素24(IL-24)为模板,构建原核表达载体pET28a-IL-24,转化大肠杆菌DH5α,挑取单克隆,测序结果显示:在IL-24第18位A→G,21位C→T,412位G→A,18位和21位的突变没有使该位上的氨基酸发生改变,而412位的突变导致了该位点上的氨基酸发生改变——由丙氨酸A变为苏氨酸T。通过设计突变引物,二次pcr将其纠正,转化大肠杆菌BL21。通过改变诱导剂IPTG的浓度、诱导时间和诱导温度摸索最佳诱导条件,SDS-PAGE、Western blot检测显示有融合蛋白6hisIL-24表达。结果表明:通过二次pcr成功构建了IL-24原核表达载体,表达产物主要以包涵体的形式存在,最佳诱导温度为28℃,最佳诱导剂浓度为1mmol/L,最佳诱导时间是8h。

关键词：大肠杆菌人白介素24 原核表达二次pcr 融合蛋白

一种从非变性聚丙烯凝胶中回收小片段DNA的方法

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生物技术通报 2015年第5期31卷 68-72页

作者：向小华焦禹顺吴新儒程亚增侯烁刘贯山王元英中国农业科学院烟草研究所中国农业科学院烟草遗传改良与生物技术重点开放实验室青岛266101 中国农业科学院研究生院北京100081 青岛农业大学农学与植物保护学院青岛266109

利用高分辨率的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、纯化特异性小片段DNA的首选方法,也是开展后续多种分子生物学试验的前提。本试验比较了改良煮沸法(液氮研磨+煮沸+低温浓缩)、煮沸法及直取法回收小片段DNA,以回收样品模板进行第二次PC... 详细信息

利用高分辨率的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、纯化特异性小片段DNA的首选方法,也是开展后续多种分子生物学试验的前提。本试验比较了改良煮沸法(液氮研磨+煮沸+低温浓缩)、煮沸法及直取法回收小片段DNA,以回收样品模板进行第二次pcr扩增,结果表明:改良方法回收的DNA的纯度高,特异性好,回收率与经典煮沸法相当。在保证回收产物的特异性时,用低温浓缩法替代乙醇/醋酸钠共沉淀也具有可行性及一定的创新性。

关键词：非变性聚丙烯凝胶 DNA小片段二次pcr 改良煮沸法胶回收

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CO1在侧耳属物种快速鉴定中的应用

CO1在侧耳属物种快速鉴定中的应用

作者：宋驰华中农业大学

学位级别：硕士

本文以侧耳属（Pleurotus）16个主要种为试验材料,根据实验室已有的侧耳属CO1基因序列信息,设计引物C0332F和C0332R,以cDNA为模板pcr扩增CO1的编码区序列,扩增产物经克隆、测序。使用软件DNAMAN和ClustalX分析试验材料的CO1编码区序列,... 详细信息

本文以侧耳属（Pleurotus）16个主要种为试验材料,根据实验室已有的侧耳属CO1基因序列信息,设计引物C0332F和C0332R,以cDNA为模板pcr扩增CO1的编码区序列,扩增产物经克隆、测序。使用软件DNAMAN和ClustalX分析试验材料的CO1编码区序列,结果表明：侧耳属种间CO1编码区序列比较保守,序列同源性在0.888-1.000之间。结合侧耳属CO1编码区序列和CO1基因序列,进一步分析发现侧耳属CO1序列间的差异主要在于内含子,其中,P. ostreatus、P. citrinopileatus、P. cornucopiae和P. eryngii var. tuoliensis序列大小分别为：1777 bp、1675 bp、2059 bp和1718 bp,序列间有1个内含子插入;P. eryngii、P. pulmonarius、P. abieticola、P. tuber-regium和P. rattenburyi序列大小分别为：3454 bp、3462 bp、3441 bp、3631 bp和4913 bp,序列间有2个内含子插入;P. australis和P. smithii序列大小分别为：4641 bp和4453bp,序列间有3个内含子插入;而P. calyptratus、P. cystidiosu、P. djamor、P. dryinus和P. eryngii var. ferulae序列间无内含子插入,大小均为321 bp。为了更加快速的鉴定侧耳属属内各种,本文以引物C0332F和C0332R为基础进行pcr扩增,可先将pcr扩增产物按条带大小分为四组,第一组为P. calyptratus、P. cystidiosu、P. djamor、P. dryinus和P. eryngii var. ferulae;第二组为P. ostreatus、P. citrinopileatus、P. cornucopiae和P. eryngii var. tuoliensis;第三组为P. eryngii、P. pulmonarius、P. abieticola和P. tuber-regium;第四组为P. rattenburyi、P. australis和P. smithii,然后根据各组菌株CO1序列间的差异,设计每个菌株的特异性引物,菌株只有使用特异引物扩增的情况下才能扩增出目的条带。根据扩增出条带的大小和有无可以准确快速的鉴定供试16个菌株。

关键词：侧耳属 DNA条形码 CO1 二次pcr 种特异引物

应用DNA提取改良和二次聚合酶链反应技术检测乌头及其炮制品

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广州中医药大学学报 2021年第2期38卷 385-391页

作者：朱高倩李双良马莉周培军蒲星宇王丽符德欢云南省药物研究所云南昆明650111 云南白药集团创新研发中心云南昆明650111 云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室云南昆明650111

【目的】筛选适用于9种乌头属植物根茎炮制前后DNA提取的方法。【方法】采用基于十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、十二烷基硫酸钠(SDS)法的12种改良方法提取9种乌头属植物根茎炮制前后DNA,考察提取缓冲液种类、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)添加... 详细信息

【目的】筛选适用于9种乌头属植物根茎炮制前后DNA提取的方法。【方法】采用基于十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、十二烷基硫酸钠(SDS)法的12种改良方法提取9种乌头属植物根茎炮制前后DNA,考察提取缓冲液种类、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)添加、水浴时间、DNA沉降方式对乌头属植物根茎炮制前后DNA提取的影响,以及二次聚合酶链反应(pcr)技术对乌头炮制品ITS2片段浓度提高的影响。【结果】不同缓冲液与水浴时间互作提取DNA效应不同,2×CTAB(含2.5 mol/L NaCl)水浴3 h提取的9种乌头生品DNA的ITS2扩增效果最佳,2×CTAB(含1.4 mol/L NaCl)水浴3 h提取的9种乌头炮制品DNA的ITS2扩增效果最佳。添加PVP或添加PVP+改变DNA沉降方式对生品DNA提取影响不大,但对炮制品有明显的抑制作用。经过二次pcr可显著提高炮制品ITS2的扩增效率。【结论】提取缓冲液和水浴时间的有效互作提取DNA以及二次pcr技术的应用可提高乌头属植物根茎ITS2片段制备效率,为DNA条形码技术广泛应用于乌头属药材提供必要的技术支持。

关键词：乌头属炮制 DNA提取二次pcr ITS2