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pVA质粒中ⅱ型分泌系统同源基因对副溶血弧菌生物学特性及PirAB表达和分泌的影响

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微生物学通报 2023年第12期50卷 5459-5474页

作者：苏彤彤唐磊莫照兰中国海洋大学三亚海洋研究院海南省热带水产种质重点实验室海南三亚572024 中国海洋大学海洋生命学院海洋生物遗传育种教育部重点实验室山东青岛266003

【背景】副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是引起养殖对虾急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)的病原之一,毒素蛋白PirAB是该病原的致病因子,由病原携带的pVA质粒上的pirA和pirB编码。PirAB的分泌途径尚未明确。【目的】探究pVA质粒中ⅱ型分泌系统同源基因epsG2和epsE2对副溶血弧菌生物学特性及PirAB表达和分泌的影响。【方法】通过生物信息学分析发现副溶血弧菌VP220218株pVA质粒上存在2个ⅱ型分泌系统(typeⅡsecretion system,T2SS)的同源基因epsG2和epsE2;利用框内缺失方法构建了突变株ΔepsG2和ΔepsE2,检测其生长、生物被膜形成、运动力和胞外蛋白酶活力的变化,进一步用RT-qPCR和Western blotting分析了PirAB表达和分泌的变化。【结果】epsG2和epsE2能够抑制VP220218的胞外蛋白酶活力(P分泌无影响,epsE2能够促进PirAB的合成和分泌。【结论】epsG2和epsE2参与了副溶血弧菌VP220218的生理活动,且epsE2影响PirAB的合成和分泌。研究结果为了解致AHPND菌PirAB毒素的合成和分泌途径提供了参考。

关键词：对虾急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌 ⅱ型分泌系统 epsG2 epsE2

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ⅱ型分泌系统与植物病原细菌致病性的关系

农业生物技术学报 2007年第3期15卷 365-370页

作者：冯洁徐进许景升何礼远中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京100094

植物病原细菌通过不同的分泌途径将毒素及酶类分泌到胞外,每种途径均具有自身的特点及局限性,主要有4种类型的分泌系统。本文着重介绍ⅱ型分泌系统与植物病原细菌致病性的关系。

关键词：细菌 ⅱ型分泌系统致病性

ⅱ型分泌系统与rpoS基因对水产致病菌溶藻弧菌致病性的影响研究

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Ⅱ型分泌系统与rpoS基因对水产致病菌溶藻弧菌致病性的影响研究

作者：郭丽娜集美大学

学位级别：硕士

溶藻弧菌是一类革兰氏阴性短杆菌、无芽孢、可运动,具有极生鞭毛、分布广泛、且主要以海水环境居多。溶藻弧菌会导致大规模弧菌病,给水产养殖业造成严重的经济损失。因此,溶藻弧菌的致病性引起了国内外专家的广泛研究。ⅱ型分泌系统（T2... 详细信息

溶藻弧菌是一类革兰氏阴性短杆菌、无芽孢、可运动,具有极生鞭毛、分布广泛、且主要以海水环境居多。溶藻弧菌会导致大规模弧菌病,给水产养殖业造成严重的经济损失。因此,溶藻弧菌的致病性引起了国内外专家的广泛研究。ⅱ型分泌系统（T2S）广泛存在于革兰氏阴性细菌中,包括人类、动物和植物病原细菌。它是革兰氏阴性菌中的常规代谢途径,向细胞外分泌各种蛋白,包括胞外酶、蛋白酶、毒素和毒性因子,这些胞外蛋白毒性因子通常破坏寄主细胞,引起组织坏死和病害。rpoS是细菌一般胁迫反应的重要调控因子,当细菌经历逆境胁迫,如:碳源或氮源饥饿、渗透压增高、低pH、温度升高等都可以诱导RpoS的表达。大量的环境以及细胞内信号参与rpoS的调控,这些调控可以发生在转录水平、翻译水平、降解过程以及活性调节等方面,最终构成一个复杂且精致的调控网络,rpoS基因是一个全局性调控因子,在病原菌的抗逆作用中也发挥重要作用。在本次实验中采用基因沉默,qRT-PCR以及体外粘附试验的方式探究溶藻弧菌的粘附与II型分泌系统中基因（secA,secD,secF,yajC和yidC）的关系。结果显示,目的基因的表达量与粘附能力都在瞬时沉默与稳定沉默后表现出显著下调。瞬时沉默之后,在第3h,secA下调2.69-倍,secD下调8.61-倍secF下调3.13-倍,yajC下调2.16-倍,yidC下调4.51-倍。对照组每个视野约为1349±76个,然而secA,secD,secF,yajC和yidC实验组每个视野约有424±41,525±34,312±44,338±32,283±50个细胞。稳定沉默后secA,secD,secF,yajC和yidC基因的表达水平分别下调了2.04-,1.46-,1.14-,2.78-和5.95-倍。与对照组的粘附相比,对照组每个视野约有1078±58个细胞,而secA,secD,secF,yajC和yidC实验组每个视野约有214±44,302±48,932±144,808±48和234±22个细胞。这些结果都显示出secA,secD,secF,yajC和yidC基因和溶藻弧菌的粘附密切相关。secA,secD,secF,yajC和yidC基因的表达量受到温度、盐度、pH和饥饿程度的显著影响。在温度为44℃时,5种基因的表达量达到最高;在盐度为3.5%时,5种基因的表达量最高;通过不同的PH进行实验处理,发现这五个目的基因的表达呈现出倒U型的趋势,当pH 7时,除了yidC基因,其它4个基因的表达水平达到顶点。推迟饥饿时间,每个基因的表达量均显著下调。这表明secA,secD,secF,yajC和yidC基因对于不同的环境因子都较为敏感,相同的环境胁迫也会导致不同基因不同的表达变化。因此环境因子可以通过secA,secD,secF,yajC和yidC基因的表达来影响溶藻弧菌的粘附作用。同时还对rpoS基因进行基因沉默,qRT-PCR实验,体外粘附试验,生长曲线的检测,溶血性实验,平板运动性实验,生物成膜实验。实验结果显示,稳定沉默后的目的基因的表达量相比野生型下调1.90-倍。对实验组与对照组分别进行体外粘附实验,结果表明,对照组每个视野约1078±58个细胞,而rpoS沉默株约有814±37个细胞。rpoS基因的表达量受到温度、盐度、pH和饥饿程度的影响显著。在44℃,rpoS基因表达量显著;在盐度为4.5%时,基因表达量最高;通过不同PH进行处理,基因的表达呈现出倒U型的趋势,基因在pH 7.0时表达水平达到最高。rpoS基因的表达水平随着饥饿时间的推移显著下降,这说明了基因对不同环境胁迫存在不同的反应,rpoS基因对环境因子的作用很敏感。对比于野生型,rpoS沉默菌株的生长曲线总体走势较低,在6.5h之前沉默株的生长速率较快,6.5h至稳定期野生型生长速率较快。溶血性也相比于溶藻弧菌野生株较为不敏感,野生型的溶血率是沉默株的4.23-倍,证明rpoS基因与溶藻弧菌的溶血性之间有内在的联系。生物成膜实验,沉默株成膜总体偏低,野生株是沉默株的1.32-倍。野生溶藻弧菌平板运动性实验强于rpoS沉默株,野生型溶藻弧菌的半径大于沉默株的半径。以上结果都都表明rpoS基因对于溶藻弧菌的溶血实验,成膜实验,生长水平以及运动情况都有密切的联系,参与其内部的调控。总之,本研究的结果表明ⅱ型分泌系统和rpoS基因对于溶藻弧菌的表达具有重要的调控作用,缺失以上基因的溶藻弧菌表达量会显著下降,同时也表明了ⅱ型分泌系统和rpoS基因对不同环境胁迫以及表型实验都是较为敏感的

关键词：水产病害溶藻弧菌 ⅱ型分泌系统 RpoS 环境胁迫 RNAi技术

嗜麦芽寡养单胞菌D2株ⅱ型分泌系统GSP基因簇的序列测定及分析

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嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统GSP基因簇的序列测定及分析

作者：罗玮青岛大学

学位级别：硕士

目的本实验室自沙蚕消化道分离得到的一株嗜麦芽寡养单胞菌D2可胞外大量分泌某蛋白（SMP）。根据已获知的部分基因组序列,发现该蛋白基因与ⅱ型分泌系统蛋白基因成簇排列,故推测D2株SMP的大量分泌可能与ⅱ型分泌系统有关。ⅱ型分泌系统... 详细信息

目的本实验室自沙蚕消化道分离得到的一株嗜麦芽寡养单胞菌D2可胞外大量分泌某蛋白（SMP）。根据已获知的部分基因组序列,发现该蛋白基因与ⅱ型分泌系统蛋白基因成簇排列,故推测D2株SMP的大量分泌可能与ⅱ型分泌系统有关。ⅱ型分泌系统的研究为探索D2株蛋白高效分泌机制奠定基础。方法将已知的嗜麦芽寡养单胞菌D2菌株SMP基因序列通过Blast软件进行对比,发现其与嗜麦芽寡养单胞菌K279a和R551-3的AKP基因序列有高度的同源性。采用基因移步法,根据菌株K279a和R551-3的基因组序列高保守区设计上游引物,根据已获知的D2株基因组序列设计下游引物进行聚合酶链反应,将PCR扩增获得的产物均连接至p MD18-T载体中并用TSS法转化大肠杆菌JM109。利用蓝白斑筛选阳性克隆,提取质粒后经双酶切鉴定确认为阳性的菌株菌液送测序。测序所得基因片段经DNASTAR软件拼接后通过Blast比对。利用ClustalX软件分析比对后得到的完整开放读码框与GenBank相关蛋白基因序列同源性,并用MEGA3.0软件进行系统发育分析;并对各蛋白的结构进行了分析和预测。结果以嗜麦芽寡养单胞菌D2株的基因组为模板进行PCR扩增、连接、转化、酶切鉴定、测序后,分别获得7个基因片段,经拼接分析后发现其中包含了11个完整开放读码框,分别对应于II型分泌系统GspF、GspE、GspD、 GspM、GspL、GspK、GspG、GspJ、Gspl、GspH、GspC蛋白（GenBank收录号依次为：GU377212、HM151387、JQ070336、JQ070343、1Q070342、JQ070341、JQ070337、JQ070340、JQ070339、JQ070338、JQ070335）。将该11个开放读码框翻译成蛋白质后与菌株R551-3的相应蛋白序列比对和系统发育分析后发现,测序获得的11种蛋白均与同种属细菌相应蛋白亲缘关系较近。结论成功获得了嗜麦芽寡养单胞菌D2株ⅱ型分泌系统gsp基因簇的完整基因序列,证明D2株gsp基因簇与smp紧密串联,且具有高度保守性,为进一步探索和开发利用D2株SMP蛋白高效胞外分泌表达机制奠定了基础。

关键词：嗜麦芽寡养单胞菌 ⅱ型分泌系统克隆测序

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嗜麦芽寡养单胞菌ⅱ型分泌系统功能的研究

嗜麦芽寡养单胞菌Ⅱ型分泌系统功能的研究

作者：任莹青岛大学

学位级别：硕士

目的本实验室在2003年自海洋生物沙蚕的消化道中分离获得一株嗜麦芽寡养单胞菌,命名为D2株,该菌株可大量分泌某种胞外蛋白(SMP)。根据前期研究发现编码此蛋白的基因与ⅱ型分泌系统其中一套基因(Gsp)成簇排列,故推测SMP蛋白的分泌可能与... 详细信息

目的本实验室在2003年自海洋生物沙蚕的消化道中分离获得一株嗜麦芽寡养单胞菌,命名为D2株,该菌株可大量分泌某种胞外蛋白(SMP)。根据前期研究发现编码此蛋白的基因与ⅱ型分泌系统其中一套基因(Gsp)成簇排列,故推测SMP蛋白的分泌可能与Gsp的ⅱ型分泌系统关系密切。本文通过基因敲除技术构建不同的突变株探索SMP蛋白的分泌机制与ⅱ型分泌系统功能之间的关系,从而为ⅱ型分泌系统功能的进一步研究奠定基础。方法根据已获得的基因序列,设计引物,利用同源重组技术构建不同的D2突变株ΔGsp E,ΔXps E,ΔGsp E+Xps E。首先,PCR扩增得到E基因上下游的同源臂以及要插入的cat序列,三种产物经过纯化之后,通过SOE-PCR技术得到融合的“上臂-cat-下臂”片段,然后使纯化后的融合片段与PMD18-T载体连接,通过蓝白斑筛选,将得到的白色单克隆菌落进行初步酶切鉴定,鉴定后的菌株送去测序。测序正确的菌株提取重组质粒后,用限制酶(Bam H I、Sac I)进行双酶切,制备足量的目的片段,同时用同种酶对p EX18Tc进行双酶切,分别纯化后将目的片段与p EX18Tc连接,得到重组自杀质粒。将重组自杀质粒转化进大肠埃希菌株SM10λpir,含有自杀质粒的菌株SM10λpir作为供体菌和受体菌D2野生株在微孔滤膜上通过性菌毛进行接合。通过接种于双抗平板进行接合子的筛选,筛选出的接合子再接种在10%的蔗糖平板上,室温下培养约48h后长出单克隆菌落,对得到的突变菌株进行PCR鉴定,将得到的突变株接种到牛肉膏蛋白胨培养基上,取培养基的上清液进行SDS-PAGE电泳;同时接种突变株和D2野生株于LB培养基,分别测定其生长曲线。结果成功构建三株突变株,分别为ΔGsp E,ΔXps E,ΔGsp E+Xps E,三株突变株和D2野生株的生长趋势基本一致。SDS-PAGE电泳后发现,敲除Gsp ⅱ型分泌系统的E基因的突变株仍有SMP蛋白的分泌,而敲除Xps ⅱ型分泌系统E基因的突变株以及两套ⅱ型分泌系统同时敲除E基因的突变株没有SMP蛋白的分泌。结论SMP蛋白的分泌机制和ⅱ型分泌系统密切相关,并且Xps ⅱ型分泌系统对SMP蛋白的分泌更加重要,对ⅱ型分泌系统功能的进一步研究奠定了基础。

关键词：嗜麦芽寡养单胞菌 ⅱ型分泌系统基因敲除胞外蛋白

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问号钩体ⅱ型分泌系统相关基因特征分析

中国生物制品学杂志 2004年第5期17卷 287-289页

作者：顾艳杨宏亮李文俊姜叙诚郭晓奎上海第二医科大学上海200025

目的　分析问号钩体ⅱ型分泌系统相关基因特征。方法　根据问号钩体黄疸出血群赖型赖株全基因组数据库 ,应用BLAST ,Tmpred ,Pfam等软件分析问号钩体ⅱ型分泌系统的基因组成和编码蛋白的结构特征 ,并比较问号钩体与铜绿假单胞菌和大肠... 详细信息

目的　分析问号钩体ⅱ型分泌系统相关基因特征。方法　根据问号钩体黄疸出血群赖型赖株全基因组数据库 ,应用BLAST ,Tmpred ,Pfam等软件分析问号钩体ⅱ型分泌系统的基因组成和编码蛋白的结构特征 ,并比较问号钩体与铜绿假单胞菌和大肠埃希菌K12ⅱ型分泌系统组成蛋白的同源性。结果　问号钩体中与ⅱ型分泌系统相关的蛋白有 11个 ,其中 6个为一般分泌途径蛋白 ,5个为Sec分泌途径蛋白 ,问号钩体中可能存在ⅱ型分泌系统 ,但一些辅助蛋白未发现 ,需要进一步研究。结论　初步预测了问号钩体中ⅱ型分泌系统的作用模式。

关键词：钩端螺旋体 ⅱ型分泌系统基因致病机制分泌途径蛋白

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青枯菌ⅱ型分泌系统编码基因的克隆

农业生物技术学报 2008年第1期16卷 138-141页

作者：张杨张争徐进许景升何礼远冯洁 100094 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京

植物青枯菌ⅱ型分泌系统与致病蛋白的分泌密切相关。编码青枯菌(Ralstonia solanacearum)ⅱ型分泌系统的gsp基因簇由12个基因组成,通过设计适合高GC%含量基因扩增的PCR反应体系,成功克隆了编码青枯菌ⅱ型分泌系统的全部12个gsp基因。分... 详细信息

植物青枯菌ⅱ型分泌系统与致病蛋白的分泌密切相关。编码青枯菌(Ralstonia solanacearum)ⅱ型分泌系统的gsp基因簇由12个基因组成,通过设计适合高GC%含量基因扩增的PCR反应体系,成功克隆了编码青枯菌ⅱ型分泌系统的全部12个gsp基因。分别将gsp基因连接到酵母双杂交系统的诱饵及捕获载体上,构建了gsp基因诱饵库和捕获库。经序列测定证明12个gsp基因读框正确,保障了其在酵母系统中的表达。

关键词：青枯菌 ⅱ型分泌系统基因克隆 gsp基因酵母双杂交系统

嗜麦芽寡养单胞菌D2株ⅱ型分泌系统GspF、E基因的序列测定及smp基因同源重组载体的构建

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嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统GspF、E基因的序列测定及smp基...

作者：辛晓妮青岛大学

学位级别：硕士

目的本实验室在2003年从海洋生物沙蚕消化道中分离出嗜麦芽寡养单胞菌D2,该菌能够大量胞外分泌某蛋白酶（protease of S. maltophilia, SMP）,且纯度高;课题组前期研究已获得了其完整的编码基因（smp）,并分析发现其可能通过Ⅱ型分泌系... 详细信息

目的本实验室在2003年从海洋生物沙蚕消化道中分离出嗜麦芽寡养单胞菌D2,该菌能够大量胞外分泌某蛋白酶（protease of S. maltophilia, SMP）,且纯度高;课题组前期研究已获得了其完整的编码基因（smp）,并分析发现其可能通过ⅱ型分泌系统分泌。为了能够明确D2株SMP蛋白的分泌表达机制,为该菌的进一步开发与利用奠定基础,本课题组拟利用同源重组技术使外源基因替换D2菌中的smP基因,通过研究突变菌株分泌表达生物活性物质的情况,对D2株SMP蛋白表达机制和嗜麦芽寡养单胞菌ⅱ型分泌系统的基因结构及功能进行分析。因此,本文旨在构建用于D2株smp基因敲除的重组自杀质粒pDS132NotI-A-tet-B;同时在上述过程中获得了D2株ⅱ型分泌系统GSP基因簇GspF和GspE两个编码基因的完整序列并进行分析。方法1.通过药敏试验（MicsroScan W/A-40全自动微生物鉴定及药敏分析系统检测和稀释法）检测嗜麦芽寡养单胞菌D2株的耐药性,以筛选同源重组实验方案中合适自杀质粒和筛选标记基因。2.根据smp基因序列和GenBank收录的K279a和R551株的高保守序列设计引物,通过基因移步法分别PCR扩增获得其上下游的基因序列。3.对在smp上游序列中发现的ⅱ型分泌系统GSP基因簇GspF和GspE两个基因进行序列和生物信息学分析。4.根据获得的卿基因的上、下游基因序列设计引物,并引入合适的酶切位点,分别扩增获得同源臂A和B;同时依据Genbank上收录的pBR322的四环素抗性基因（tet）设计引物,扩增获得筛选标记tet的完整ORF基因片段;以上各引物设计时同时引入适当长度的互补序列,以用于SOE-PCR连接。***-PCR连接扩增同源臂A、基因tet和同源臂B,得到三段的嵌合基因序列A-tet-B。6.分别用Not I酶切自杀质粒pDS132NotI和pMD18T-A-tet-B,连接构建重组自杀质粒pDS132NotI-A-tet-B,并进行测序分析。结果1.两种药敏试验方法检测显示D2株对氯霉素和四环素敏感,对多种抗生素耐药,故选择pDS132质粒（catr）和DH5αλpir株（cat-）为同源重组的载体系统,选择tet基因为同源重组的筛选标记。2.在D2株smp基因5’拼接三段序列含有两个完整开放读码框架（ORF）,分别为1200bp GspF基因（GenBank收录号GU377212.1）和1434bpGspE基因（GenBank（?）录号HM151387）。在GenBank中BLAST分析发现,D2株与嗜麦芽寡养单胞菌R551-3株的GspF基因及氨基酸序列同源性分别为93%和98%;GspE基因及氨基酸序列同源性分别为92%和99%。3.酶切鉴定证实SOE-PCR产物A-tet-B与自杀质粒pDS132NotI成功连接,测序分析发现同源臂A序列与设计完全一致,筛选基因tet部分与GenBank收录质粒pBR322的四环素抗性基因（tet）完全一致,同源臂B片段与原序列只有5个碱基不同,保真性达98%。结论检测出D2株敏感性抗生素氯霉素（MIC为25μg/ml）、四环素（MIC为12.5μg/ml）;克隆出嗜麦芽寡养单胞菌D2株ⅱ型分泌系统基因簇中的GspF和GspE完整编码序列;嗜麦芽寡养单胞菌GspF和GspE种内高度保守,而对其他细菌差异显著,提示其Ⅱ型分泌机制可能与其他革兰阴性菌有一定差异。SOE-PCR连接扩增三段基因A-tet-B。构建了用于下一步基因敲除重组自杀质粒pDS132NotI-A-tet-B。

关键词：嗜麦芽寡养单胞菌 ⅱ型分泌系统 SOE-PCR 同源重组

嗜麦芽寡养单胞菌D2株第2套ⅱ型分泌系统全基因簇序列测定分析及其E基因部分敲除

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嗜麦芽寡养单胞菌D2株第2套Ⅱ型分泌系统全基因簇序列测定分析及...

作者：张卫青岛大学

学位级别：硕士

目的本实验室自2003年从沙蚕消化道分离出一株嗜麦芽寡养单胞菌D2株,研究发现该菌可胞外大量分泌有碱性磷酸酶活性的D2蛋白。根据已测定出的部分基因组序列,发现编码D2蛋白的基因与Ⅱ型蛋白分泌系统基因成簇排列,故推测嗜麦芽寡养单胞... 详细信息

目的本实验室自2003年从沙蚕消化道分离出一株嗜麦芽寡养单胞菌D2株,研究发现该菌可胞外大量分泌有碱性磷酸酶活性的D2蛋白。根据已测定出的部分基因组序列,发现编码D2蛋白的基因与Ⅱ型蛋白分泌系统基因成簇排列,故推测嗜麦芽寡养单胞菌D2株的D2蛋白可能与Ⅱ型蛋白分泌系统有关。测定嗜麦芽寡养单胞菌D2株第二套ⅱ型分泌系统(T2SS2)全基因簇(Gsp)的基因序列,并对所测定的序列进行生物信息学分析,再此基础上构建嗜麦芽寡养单胞菌D2株的T2SS2的△Gsp2E基因缺失株,分析T2SS2的Gsp2E对嗜麦芽寡养单胞菌D2株分泌D2蛋白的影响。方法1.根据Genbank基因组计划中公布的4株嗜麦芽寡养单胞菌K279a、JV3、D457、 R551-a (Genbank登陆号依次为：NC1094、NC15947、NC17671、NC11071)的ⅱ型分泌系统基因簇序列,以及D2株的部分测序结果设计引物,采用基因移步法逐一PCR扩增第2套ⅱ型分泌系统基因序列,PCR产物连接至pGEM-18T载体,蓝白斑选择后经酶切鉴定送往测序公司测序,序列结果拼接后寻找各个基因簇的开放多码框架(ORF),并进行生物信息学分析。2.通过PCR来扩增氯霉素基因和嗜麦芽寡养单胞菌D2株Gsp2E基因的上下游片段,分别作为上游和下游的同源臂,采用搭桥PCR方法将上游同源臂、氯霉素基因及下游同源臂连接。对搭桥PCR片段和自杀质粒pGEX-18TC分别进行双酶切之后用连接酶连接,获得重组自杀质粒△2E-pEX-18TC,将该质粒转化入大肠杆菌SM10λpir株中。通过第一次同源重组,将自杀质粒△E-pEX-18TC转入嗜麦芽寡养单胞菌D2株中,利用氯霉素和链霉素双抗平板筛选出结合子。通过第二次同源重组筛选出△2E缺失株,并进行PCR鉴定。结果1.共获得嗜麦芽寡养单胞菌D2株第二套ⅱ型分泌系统基因簇共11个片段,依次为Gsp2E、Gsp2F、Gsp2G、Gsp2H、Gsp2I、Gsp2J、Gsp2K、Gsp2L、Gsp2M、Gsp2N、 Gsp2D。对应的GenBank收录号依次为KF234409、KF234410、KF23441、KF234412、 KF2344113、KF234414、KF234415、KF234416、KF234417、KF234418、KF234419。对上述11个ORF比对分析后发现T2SS2的基因簇与同种属细菌K279a, R551-a对应蛋白基因同源性均在85%以上,相应氨基酸序列同源性均能达到70%以上,与T2SS1相比,两套ⅱ型分泌系统之间有一定的同源性,其中以E基因片段为代表,基因同源性最高为68%,相应蛋白同源性为61%,其余基因簇片段基因及蛋白同源性均不及E基因高,大多位于30%左右。此外对以上11个ORF和来源明确的其他细菌相应蛋白做系统发育树分析,发现第二套ⅱ型分泌系统基因簇有种属特异性。2.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对△Gsp2E嗜麦芽寡养单胞菌D2株的D2蛋白进行检测,结果发现△Gsp2E嗜麦芽寡养单胞菌D2株与野生株在D2蛋白量上无明显差别,药敏实验显示：与对氯霉素敏感的野生株相比△Gsp2E嗜麦芽寡养单胞菌D2株对氯霉素明显耐药,提示用氯霉素基因替换Gsp2E基因成功。生化检测显示L-亮氨酸-AMC呈阳性改变,L-色氨酸-AMC呈阴性改变。结论成功测定出嗜麦芽寡养单胞菌D2株第二套ⅱ型分泌系统全基因簇序列,通过对比分析和构建的发育树图发现该11个基因序列与同菌属细菌的分泌系统同源性较高,跟不同种属的同种蛋白同源性较低。Gsp2E基因敲除为进一步探究Gap2E在蛋白分泌中的作用奠定基础。

关键词：嗜麦芽寡养单胞菌 ⅱ型分泌系统克隆测序 Gsp2E