嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统GspF、E基因的序列测定及smp基因同源重组载体的构建

作     者：辛晓妮 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：闫志勇

授予年度：2011年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：嗜麦芽寡养单胞菌 Ⅱ型分泌系统 SOE-PCR 同源重组 

摘      要：目的本实验室在2003年从海洋生物沙蚕消化道中分离出嗜麦芽寡养单胞菌D2,该菌能够大量胞外分泌某蛋白酶（protease of S. maltophilia, SMP）,且纯度高;课题组前期研究已获得了其完整的编码基因（smp）,并分析发现其可能通过Ⅱ型分泌系统分泌。为了能够明确D2株SMP蛋白的分泌表达机制,为该菌的进一步开发与利用奠定基础,本课题组拟利用同源重组技术使外源基因替换D2菌中的smP基因,通过研究突变菌株分泌表达生物活性物质的情况,对D2株SMP蛋白表达机制和嗜麦芽寡养单胞菌Ⅱ型分泌系统的基因结构及功能进行分析。因此,本文旨在构建用于D2株smp基因敲除的重组自杀质粒pDS132NotI-A-tet-B;同时在上述过程中获得了D2株Ⅱ型分泌系统GSP基因簇GspF和GspE两个编码基因的完整序列并进行分析。 方法1.通过药敏试验（MicsroScan W/A-40全自动微生物鉴定及药敏分析系统检测和稀释法）检测嗜麦芽寡养单胞菌D2株的耐药性,以筛选同源重组实验方案中合适自杀质粒和筛选标记基因。2.根据smp基因序列和GenBank收录的K279a和R551株的高保守序列设计引物,通过基因移步法分别PCR扩增获得其上下游的基因序列。3.对在smp上游序列中发现的Ⅱ型分泌系统GSP基因簇GspF和GspE两个基因进行序列和生物信息学分析。4.根据获得的卿基因的上、下游基因序列设计引物,并引入合适的酶切位点,分别扩增获得同源臂A和B;同时依据Genbank上收录的pBR322的四环素抗性基因（tet）设计引物,扩增获得筛选标记tet的完整ORF基因片段;以上各引物设计时同时引入适当长度的互补序列,以用于SOE-PCR连接。***-PCR连接扩增同源臂A、基因tet和同源臂B,得到三段的嵌合基因序列A-tet-B。6.分别用Not I酶切自杀质粒pDS132NotI和pMD18T-A-tet-B,连接构建重组自杀质粒pDS132NotI-A-tet-B,并进行测序分析。 结果1.两种药敏试验方法检测显示D2株对氯霉素和四环素敏感,对多种抗生素耐药,故选择pDS132质粒（catr）和DH5αλpir株（cat-）为同源重组的载体系统,选择tet基因为同源重组的筛选标记。2.在D2株smp基因5’拼接三段序列含有两个完整开放读码框架（ORF）,分别为1200bp GspF基因（GenBank收录号GU377212.1）和1434bpGspE基因（GenBank（?）录号HM151387）。在GenBank中BLAST分析发现,D2株与嗜麦芽寡养单胞菌R551-3株的GspF基因及氨基酸序列同源性分别为93%和98%;GspE基因及氨基酸序列同源性分别为92%和99%。3.酶切鉴定证实SOE-PCR产物A-tet-B与自杀质粒pDS132NotI成功连接,测序分析发现同源臂A序列与设计完全一致,筛选基因tet部分与GenBank收录质粒pBR322的四环素抗性基因（tet）完全一致,同源臂B片段与原序列只有5个碱基不同,保真性达98%。结论检测出D2株敏感性抗生素氯霉素（MIC为25μg/ml）、四环素（MIC为12.5μg/ml）;克隆出嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统基因簇中的GspF和GspE完整编码序列;嗜麦芽寡养单胞菌GspF和GspE种内高度保守,而对其他细菌差异显著,提示其Ⅱ型分泌机制可能与其他革兰阴性菌有一定差异。SOE-PCR连接扩增三段基因A-tet-B。构建了用于下一步基因敲除重组自杀质粒pDS132NotI-A-tet-B。