嗜麦芽寡养单胞菌D2株第2套Ⅱ型分泌系统全基因簇序列测定分析及其E基因部分敲除

作     者：张卫 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：闫志勇

授予年度：2014年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：嗜麦芽寡养单胞菌 Ⅱ型分泌系统 克隆 测序 Gsp2E 

摘      要：目的本实验室自2003年从沙蚕消化道分离出一株嗜麦芽寡养单胞菌D2株,研究发现该菌可胞外大量分泌有碱性磷酸酶活性的D2蛋白。根据已测定出的部分基因组序列,发现编码D2蛋白的基因与Ⅱ型蛋白分泌系统基因成簇排列,故推测嗜麦芽寡养单胞菌D2株的D2蛋白可能与Ⅱ型蛋白分泌系统有关。测定嗜麦芽寡养单胞菌D2株第二套Ⅱ型分泌系统(T2SS2)全基因簇(Gsp)的基因序列,并对所测定的序列进行生物信息学分析,再此基础上构建嗜麦芽寡养单胞菌D2株的T2SS2的△Gsp2E基因缺失株,分析T2SS2的Gsp2E对嗜麦芽寡养单胞菌D2株分泌D2蛋白的影响。 方法1.根据Genbank基因组计划中公布的4株嗜麦芽寡养单胞菌K279a、JV3、D457、 R551-a (Genbank登陆号依次为：NC1094、NC15947、NC17671、NC11071)的Ⅱ型分泌系统基因簇序列,以及D2株的部分测序结果设计引物,采用基因移步法逐一PCR扩增第2套Ⅱ型分泌系统基因序列,PCR产物连接至pGEM-18T载体,蓝白斑选择后经酶切鉴定送往测序公司测序,序列结果拼接后寻找各个基因簇的开放多码框架(ORF),并进行生物信息学分析。2.通过PCR来扩增氯霉素基因和嗜麦芽寡养单胞菌D2株Gsp2E基因的上下游片段,分别作为上游和下游的同源臂,采用搭桥PCR方法将上游同源臂、氯霉素基因及下游同源臂连接。对搭桥PCR片段和自杀质粒pGEX-18TC分别进行双酶切之后用连接酶连接,获得重组自杀质粒△2E-pEX-18TC,将该质粒转化入大肠杆菌SM10λpir株中。通过第一次同源重组,将自杀质粒△E-pEX-18TC转入嗜麦芽寡养单胞菌D2株中,利用氯霉素和链霉素双抗平板筛选出结合子。通过第二次同源重组筛选出△2E缺失株,并进行PCR鉴定。 结果1.共获得嗜麦芽寡养单胞菌D2株第二套Ⅱ型分泌系统基因簇共11个片段,依次为Gsp2E、Gsp2F、Gsp2G、Gsp2H、Gsp2I、Gsp2J、Gsp2K、Gsp2L、Gsp2M、Gsp2N、 Gsp2D。对应的GenBank收录号依次为KF234409、KF234410、KF23441、KF234412、 KF2344113、KF234414、KF234415、KF234416、KF234417、KF234418、KF234419。对上述11个ORF比对分析后发现T2SS2的基因簇与同种属细菌K279a, R551-a对应蛋白基因同源性均在85%以上,相应氨基酸序列同源性均能达到70%以上,与T2SS1相比,两套Ⅱ型分泌系统之间有一定的同源性,其中以E基因片段为代表,基因同源性最高为68%,相应蛋白同源性为61%,其余基因簇片段基因及蛋白同源性均不及E基因高,大多位于30%左右。此外对以上11个ORF和来源明确的其他细菌相应蛋白做系统发育树分析,发现第二套Ⅱ型分泌系统基因簇有种属特异性。2.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对△Gsp2E嗜麦芽寡养单胞菌D2株的D2蛋白进行检测,结果发现△Gsp2E嗜麦芽寡养单胞菌D2株与野生株在D2蛋白量上无明显差别,药敏实验显示：与对氯霉素敏感的野生株相比△Gsp2E嗜麦芽寡养单胞菌D2株对氯霉素明显耐药,提示用氯霉素基因替换Gsp2E基因成功。生化检测显示L-亮氨酸-AMC呈阳性改变,L-色氨酸-AMC呈阴性改变。结论成功测定出嗜麦芽寡养单胞菌D2株第二套Ⅱ型分泌系统全基因簇序列,通过对比分析和构建的发育树图发现该11个基因序列与同菌属细菌的分泌系统同源性较高,跟不同种属的同种蛋白同源性较低。Gsp2E基因敲除为进一步探究Gap2E在蛋白分泌中的作用奠定基础。