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OTUD4调控ΔNP63α维持乳腺癌干性的机制研究

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OTUD4调控ΔNP63α维持乳腺癌干性的机制研究

作者：赵钰安徽理工大学

学位级别：硕士

目的:乳腺癌是女性中最常见的癌症,是女性癌症死亡的首要原因。乳腺癌干细胞是类似于成体干细胞特性的一类细胞,具有自我更新、多向分化以及体内成瘤的能力。P63是P53抑癌基因的同源物,它有两种主要的亚型:具有反式激活结构域的亚型(TAP... 详细信息

目的:乳腺癌是女性中最常见的癌症,是女性癌症死亡的首要原因。乳腺癌干细胞是类似于成体干细胞特性的一类细胞,具有自我更新、多向分化以及体内成瘤的能力。P63是P53抑癌基因的同源物,它有两种主要的亚型:具有反式激活结构域的亚型(TAP63)和不具有反式激活结构域的亚型(Δnp63)。之前研究表明,ΔNP63α在乳腺癌中表达最丰富,是肿瘤干细胞和肿瘤发生的关键基因。赖氨酸甲基转移酶SETDB2是SUV亚家族成员,介导组蛋白H3K9甲基化和非组蛋白Δnp63的甲基化。我们课题组前期已经报道SETDB2能够增加Δnp63的稳定性,但其机制还不清楚。方法:1、用免疫亲和纯化结合质谱分析鉴定SETDB2的相互作用蛋白;2、蛋白免疫沉淀验证SETDB2与OTUD4、OTUD4与ΔNP63α之间的相互作用;3、用泛素化实验检测OTUD4对ΔNP63α的去泛素化作用;4、构建OTUD4的敲低稳系;5、用微球体形成实验分析OTUD4敲低对乳腺癌细胞成球能力的影响;6、用流式细胞仪检测OTUD4敲低对乳腺癌干细胞形成的影响;7、用蛋白合成抑制剂CHX和蛋白酶体抑制剂MG132处理乳腺癌细胞,检测OTUD4对ΔNP63α稳定性的影响;8、用Q-PCR验证OTUD4敲低对ΔNP63α下游基因的影响。结果:1、经过免疫亲和纯化结合质谱分析鉴定组蛋白甲基转移酶SETDB2的相互作用蛋白——去泛素化酶蛋白OTUD4,免疫共沉淀分析发现OTUD4与SETDB2有相互作用;2、OTUD4与ΔNP63α存在相互作用,且SETDB2能加强OTUD4与ΔNP63α的相互作用;3、OTUD4可以稳定ΔNP63α,进而上调ΔNP63α下游靶基因Ptch1、FOXN3、WISP2和SELENBP1的转录水平;4、OTUD4敲低明显降低乳腺癌细胞的干性。结论:SETDB2招募OTUD4并增强OTUD4与ΔNP63α的相互作用稳定ΔNP63α,维持乳腺癌干细胞。图[7]表[18]参[64]

关键词：乳腺癌乳腺癌干细胞 OTUD4 ΔNP63α

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ΔNP63α在恶性肿瘤中的研究进展

华西医学 2023年第2期38卷 304-310页

作者：高自平梁卫东陈虎司莹丽杨博成都医学院第一附属医院胸心外科成都610500

转录因子p63起源于p53蛋白家族,由TP63基因编码。TP63基因包含两个不同的启动子,编码TAp63和Δnp63两种蛋白,两种蛋白可经剪切产生p63α、p63β和p63δ等亚型。ΔNP63α是TP63基因的启动子之一,作为核心调控因子在表观遗传和转录水平调... 详细信息

转录因子p63起源于p53蛋白家族,由TP63基因编码。TP63基因包含两个不同的启动子,编码TAp63和Δnp63两种蛋白,两种蛋白可经剪切产生p63α、p63β和p63δ等亚型。ΔNP63α是TP63基因的启动子之一,作为核心调控因子在表观遗传和转录水平调控基因表达。最近的研究表明,ΔNP63α表达异常可致多种恶性肿瘤发生,同时降低恶性肿瘤对放射、化学治疗的敏感性。因此,ΔNP63α可作为恶性肿瘤诊断标志物和治疗靶点。该文就ΔNP63α在恶性肿瘤中的作用机制、耐药性等最新研究进展进行了综述。

关键词： ΔNP63α 恶性肿瘤治疗靶点

子宫颈癌细胞中STAT3对ΔNP63α的转录调控机制研究

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安徽医科大学学报 2018年第1期53卷 35-40页

作者：钱莉莉宋伟国王娟申震吴大保肖卫华单革周颖安徽医科大学附属省立医院妇产科合肥230001 中国科学院天然免疫与慢性疾病重点实验室中国科学技术大学生命科学院合肥230021

目的探讨ΔNP63α在子宫颈癌细胞株中的转录调控机制。方法通过生物信息学分析ΔNP63α可能转录调控因子,构建ΔNP63α启动子报告基因质粒,在HEK293T及子宫颈癌细胞中通过报告基因检测ΔNP63α及细胞信号转导与转录激活因子(STAT3)对ΔN... 详细信息

目的探讨ΔNP63α在子宫颈癌细胞株中的转录调控机制。方法通过生物信息学分析ΔNP63α可能转录调控因子,构建ΔNP63α启动子报告基因质粒,在HEK293T及子宫颈癌细胞中通过报告基因检测ΔNP63α及细胞信号转导与转录激活因子(STAT3)对ΔNP63α转录水平的调控。通过STAT3的激活剂及抑制剂,检测子宫颈癌细胞株中ΔNP63α的蛋白表达情况。通过Western blot检测ΔNP63α的表达水平对子宫颈癌细胞株中P-STAT3的表达影响。结果 (1)成功构建了含ΔNP63α启动子的质粒并通过酶切及测序验证;(2)荧光素酶报告基因检测系统显示ΔNP63α、STAT3均可以激活ΔNP63α启动子的表达;(3)Western blot结果显示:STAT3激活剂及抑制剂分别可以激活或抑制ΔNP63α蛋白的表达水平;(4)Western blot结果显示:ΔNP63α蛋白的过表达或沉默可以抑制子宫颈癌细胞株中STAT3的磷酸化,而对正常细胞株HEK293T没有相应的调控作用。结论子宫颈癌细胞株中STAT3可以正性调控ΔNP63α的表达,而ΔNP63α的表达上调负反馈抑制STAT3的磷酸化,推测ΔNP63α可能通过与STAT3的复杂调控机制影响肿瘤细胞的恶性生物学行为。

关键词：子宫颈癌 ΔNP63α STAT3 IL-6

ΔNP63α基因过表达对人宫颈癌细胞SiHa基因表达谱的影响

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安徽医科大学学报 2017年第2期52卷 181-186页

作者：韩晓慧赵卫东方慧英安徽医科大学附属省立医院妇产科合肥230001 安徽省肿瘤医院妇瘤科合肥230031 安徽人口职业学院池州247099

目的分析ΔNP63α基因过表达时人宫颈癌细胞SiHa基因表达谱的变化,筛选受ΔNP63α调控的潜在靶基因。方法利用慢病毒转染技术构建稳定过表达ΔNP63α的转染组细胞株SiHa-ΔNP63α和对照组细胞株SiHa-NC。应用基因芯片技术研究两组细胞... 详细信息

目的分析ΔNP63α基因过表达时人宫颈癌细胞SiHa基因表达谱的变化,筛选受ΔNP63α调控的潜在靶基因。方法利用慢病毒转染技术构建稳定过表达ΔNP63α的转染组细胞株SiHa-ΔNP63α和对照组细胞株SiHa-NC。应用基因芯片技术研究两组细胞株基因表达谱变化,并进行生物学信息分析和实时荧光定量PCR验证。结果基因芯片数据共筛选出差异倍数1.5倍以上的基因共1 405个,其中843个基因在SiHa-ΔNP63α细胞中表达上调,562个表达下调。通过生物信息学分析显示这些基因主要参与细胞生长与周期、信号转导、细胞通讯、细胞黏附、细胞转移和侵袭等功能,涉及的信号通路包括抗原加工提呈、细胞因子与受体相互作用、细胞黏附分子、补体系统等。结论研究ΔNP63α调控的潜在靶基因或信号通路,对探索宫颈癌发生发展的机制有重要意义。

关键词：宫颈癌基因表达谱 ΔNP63α 实时荧光定量PCR

宫颈癌细胞中ΔNP63α对白血病抑制因子表达水平的影响及其机制

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肿瘤防治研究 2016年第7期43卷 545-549页

作者：徐菲钱莉莉王慧妍孙正伟程勇赵卫东肖卫华周颖安徽医科大学附属省立医院妇产科合肥230001 安徽医科大学附属省立医院放射治疗科合肥230001 中国科技大学生命科学院合肥230001

目的探讨ΔNP63α对白血病抑制因子表达水平的影响及其机制。方法通过稳定转染构建稳定过表达ΔNP63α的SiHa细胞株(SiHa/ΔNP63α);通过瞬时转染沉默ME-180细胞中ΔNP63α的表达水平;并通过Western blot检测两组细胞中ΔNP63α、LIF、S... 详细信息

目的探讨ΔNP63α对白血病抑制因子表达水平的影响及其机制。方法通过稳定转染构建稳定过表达ΔNP63α的SiHa细胞株(SiHa/ΔNP63α);通过瞬时转染沉默ME-180细胞中ΔNP63α的表达水平;并通过Western blot检测两组细胞中ΔNP63α、LIF、STAT3的蛋白水平,通过qRT-PCR检测两组细胞中ΔNP63α、LIF、STAT3、LncRNA ENST00000447565的转录水平。结果 (1)ΔNP63α过表达的SiHa细胞中,LIF的mRNA及蛋白水平均明显下调,其调控的下游基因STAT3的mRNA表达水平也显著下降;(2)ΔNP63α过表达的SiHa细胞中,LncRNA ENST00000447565的转录水平显著下调,该LncRNA与LIF基因均在22号染色体q12.2,且基因组位置接近;(3)ΔNP63α沉默的ME-180细胞中,LIF的表达量明显上调。结论ΔNP63α可以抑制LIF及下游基因STAT3的表达水平,其机制可能与ΔNP63α对LncRNA ENST00000447565的表达抑制有关。

关键词： ΔNP63α 白血病抑制因子 LncRNA 子宫颈癌

宫颈癌细胞中ΔNP63α的MicroRNA表达谱及其对hsa-let-7b-3p的调控机制

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肿瘤防治研究 2018年第3期45卷 138-143页

作者：宋伟国钱莉莉吴大保申震朱靖程勇肖卫华周颖安徽医科大学附属省立医院妇产科合肥230001 安徽医科大学附属省立医院放疗科合肥230001 中国科学院天然免疫与慢性疾病重点实验室中国科学技术大学生命科学院合肥230021

目的在宫颈鳞癌细胞中筛选出ΔNP63α显著调控的mi RNAs,并探讨其对宫颈癌细胞功能的影响。方法通过mi RNA芯片技术筛选出ΔNP63α过表达的Si Ha细胞株(Si Ha/p63)中差异明显的mi RNAs,并进行q RT-PCR验证;通过q RT-PCR在沉默ΔNP63α的... 详细信息

目的在宫颈鳞癌细胞中筛选出ΔNP63α显著调控的mi RNAs,并探讨其对宫颈癌细胞功能的影响。方法通过mi RNA芯片技术筛选出ΔNP63α过表达的Si Ha细胞株(Si Ha/p63)中差异明显的mi RNAs,并进行q RT-PCR验证;通过q RT-PCR在沉默ΔNP63α的ME-180细胞株(ME-180/Shp63)中检测差异表达的mi RNAs,并选择差异较显著的hsa-let-7b-3p作为研究对象;向Si Ha细胞中转染hsa-let-7b-3p刺激剂,通过生长曲线、Western blot以及流式细胞仪检测hsa-let-7b-3p对Si Ha细胞增殖及凋亡的影响。结果 (1)在ΔNP63α过表达的Si Ha细胞株中,筛选出10个变化较显著的mi RNAs;(2)在ΔNP63α沉默的ME-180细胞中,筛选出5个与上述变化趋势一致的mi RNAs;(3)hsa-let-7b-3p过表达抑制Si Ha细胞的增殖;(4)hsa-let-7b-3p过表达促进Si Ha细胞的凋亡。结论宫颈癌细胞株中,mi RNA hsalet-7b-3p的表达与ΔNP63α的表达呈正相关,且可以有效抑制细胞增殖,其作用机制可能与诱导细胞周期阻滞和促进细胞凋亡相关。

关键词： ΔNP63α 子宫颈癌 miRNA hsa-let-7b-3p 增殖凋亡

ΔNP63α对下咽鳞状细胞癌上皮—间质转化的作用研究

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ΔNp63α对下咽鳞状细胞癌上皮—间质转化的作用研究

作者：周梦燕第二军医大学

学位级别：硕士

研究背景:下咽癌是常见的头颈部恶性肿瘤,在我国下咽癌发病率约为0.29/10万。而在欧美国家下咽癌约占头颈部恶性肿瘤的3%-5%,约94.9%的病理类型为鳞状细胞癌。由于肿瘤恶性程度高以及侵袭能力强,易发生局部或者远处转移,其预后极差,五... 详细信息

研究背景:下咽癌是常见的头颈部恶性肿瘤,在我国下咽癌发病率约为0.29/10万。而在欧美国家下咽癌约占头颈部恶性肿瘤的3%-5%,约94.9%的病理类型为鳞状细胞癌。由于肿瘤恶性程度高以及侵袭能力强,易发生局部或者远处转移,其预后极差,五年生存率在头颈部肿瘤中最低。为提高下咽鳞状细胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC)转移的早期诊治、改善病人临床预后,有必要研究HSCC发生发展和转移机制,探讨调控其迁移和侵袭的主要因素,可为临床诊治提供新的思路。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞的迁移和运动能力增加,从而转化成易发生侵袭和迁移的具有间质细胞特性的细胞,它是肿瘤发生转移的重要早期事件之一。EMT进程涉及的调控网络和蛋白较复杂,包括E-钙黏蛋白(E-cadherin)等上皮细胞标志蛋白和波形蛋白(Vimentin)等间质细胞标志蛋白。E-cadherin和Vimentin是肿瘤EMT最重要的指示蛋白。在EMT进程中,E-cadherin表达下调、Vimentin表达上调,提示肿瘤细胞向间充质表型转换,肿瘤发生了转移。p63是p53基因家族的一员,与p53在序列和结构上具有高度同源性,其在头颈部组织主要表达亚型为ΔNP63α,可通过竞争结合下游靶基因DNA结合位点的方式拮抗p63其他亚型和p53的生物学功能,在细胞增殖和凋亡等多个生理病理过程中发挥重要作用。目前多项研究证明ΔNP63α在头颈部恶性肿瘤中可调控增殖、耐药等方面,但其在HSCC中对迁移侵袭的主要方式EMT的调控未有相关研究。因此我们在本课题中通过多种实验技术在不同层面研究探讨ΔNP63α对HSCC的EMT调控作用。第一部分ΔNP63α在头颈部鳞癌细胞株中表达与EMT关系研究研究目的:研究在4株头颈部鳞癌细胞株(HNC030#13、TU212、FADU及CAL-27)中Δnp63的主要表达亚型和表达水平及,各细胞EMT标志蛋白表达和细胞迁移侵袭能力水平,初步探讨ΔNP63α在头颈部鳞癌细胞株中对EMT调控关系。研究方法:在4株头颈部鳞癌细胞株中采用Real-time PCR、Western Blot实验检测ΔNP63α蛋白与EMT标志蛋白表达水平。采用细胞划痕修复实验检测头颈部鳞癌细胞株的细胞迁移能力。采用细胞侵袭实验检测头颈部鳞癌细胞株的细胞侵袭能力。研究结果:头颈部鳞癌中Δnp63主要表达的亚型为ΔNP63α。下咽鳞癌细胞株hnc030#13中ΔNP63α、e-cadherin几乎不表达,而头颈部鳞癌细胞胞株tu212两者高表达,差异具有统计学意义(pΔNP63α表达较多的喉鳞癌细胞株tu212的迁移、侵袭能力较低,而ΔNP63α未检测到明显表达的下咽鳞癌细胞株hnc030#13的迁移侵袭能力最为显著,差异具有统计学意义(pΔNP63α在头颈部鳞癌细胞株中可能抑制emt作用。第二部分ΔNP63α重组慢病毒构建及其调控下咽鳞癌emt作用研究研究目的:研究下咽鳞癌细胞株中ΔNP63α表达水平改变对细胞emt标志蛋白表达以及功能学方面的影响,探讨ΔNP63α在下咽鳞癌中对细胞emt进程的调控作用。研究方法:采用构建ΔNP63α过表达慢病毒转染下咽鳞癌细胞株hnc030#13并药物筛选构建稳转株。在稳转株中采用real-timepcr、westernblot实验检测ΔNP63α蛋白与emt标志蛋白表达水平的改变。采用细胞划痕修复实验检测头颈部鳞癌细胞株的细胞迁移能力。采用细胞侵袭实验检测头颈部鳞癌细胞株的细胞侵袭能力。研究结果:lv-ΔNP63α的hnc030#13细胞由长梭形的间充质细胞外形向鹅卵石样上皮细胞外形转变。过表达ΔNP63α后出现emt标志蛋白e-cadherin明显表达增多,差异具有统计学意义(pΔNP63α的hnc030#13细胞迁移、侵袭能力明显下降(pΔNP63α在下咽鳞癌细胞株中表达可抑制肿瘤细胞emt的进程。第三部分ΔNP63α及emt相关标志物在下咽鳞癌中的表达及相关性研究研究目的:探讨ΔNP63α和上皮-间质转化相关分子标志物(e-cadherin、vimentin)在hscc组织中表达相关性及其临床意义。研究方法:收集第二军医大学长海医院耳鼻咽喉头颈外科2013年1月至2016年11月收治的98例hscc患者的肿瘤组织及癌旁组织标本。采用免疫组织化学法检测各类组织及肿瘤不同区域中ΔNP63α、e-cadherin、vimentin蛋白的表达水平,采用spearmen等级相关检验分析各蛋白表达的相关性,采用秩和检验比较各蛋白表达水平与患者临床病理特征的相关性。研究结果:在肿瘤组织中,ΔNP63α与e-cadherin的表达呈正相关(p

关键词：下咽鳞状细胞癌 ΔNP63α 上皮间质转化免疫组织化学

宫颈癌中ΔNP63α的LncRNA表达谱及其抑制LIF表达的分子机制

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宫颈癌中ΔNp63α的LncRNA表达谱及其抑制LIF表达的分子机制

作者：徐菲安徽医科大学

学位级别：硕士

研究背景作为p53家族的成员,p63根据其N端转录激活区不同分为TA型和ΔN型,根据转录本3’端的选择性剪切产生不同的C端,至少包含6种亚型TAp63a,TAp63β,TAp63γ,Δnp63a,Δnp63β,Δnp63γ[2-4]。p63是诱导基底细胞分化的重要调控基因,... 详细信息

研究背景作为p53家族的成员,p63根据其N端转录激活区不同分为TA型和ΔN型,根据转录本3’端的选择性剪切产生不同的C端,至少包含6种亚型TAp63a,TAp63β,TAp63γ,Δnp63a,Δnp63β,Δnp63γ[2-4]。p63是诱导基底细胞分化的重要调控基因,并且特别是在上皮分层和终末分化过程中。本课题组前期研究结果发现,ΔΝp63α是宫颈上皮组织中主要的表达亚型,在低分化的宫颈鳞癌中表达量低。LncRNA是一类大于200个核苷酸的非编码RNA[24]。因与肿瘤的紧密关联而备受瞩目。LncRNAs可以在各种水平上调节基因表达,包括染色质修饰,转录和转录后调控。LncRNA的异常表达会引起癌症的发生和进展,包括乳腺癌,肺腺癌和宫颈癌。本研究的目的是探讨子宫颈癌中ΔNP63α的LncRNA表达谱。通过分析这些筛选出mRNA和LncRNA,来构建ΔNP63α调控上皮增殖和分化的调控网络。方法通过慢病毒载体的构建和包装体系,构建了ΔNP63α稳定表达的SiHa细胞系及其对照细胞,分别命名为SiHa/ΔNP63α和SiHa/con。通过对SiHa/ΔNP63α细胞系及其对照细胞进行芯片测序,检测出有明显表达差异的mRNA和LncRNA。通过qRT-PCR在SiHa/ΔNP63α细胞系和瞬时沉默ΔNP63α的ME-180的细胞中多次验证候选序列,筛选出与ΔNP63α有明显相关性的mRNA和LncRNA,并对其进行分析。结果1.通过ΔNP63α的LncRNA表达谱分析和qRT-PCR验证,我们筛选出9个与ΔNP63α具有相关性的LncRNA,包括ENST00000447565（Lnc-LIF-AS）,TCONS00012062,ENST00000570197,ENST00000563036,TCONS00011964,ENST00000439517,TCONS00004869,TCONS00014003,ENST00000469965。2.对这些LncRNA的UCSC分析之后,我们发现了由Lnc-LIF-AS和ΔNP63α共同调节的靶基因白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）。ΔNP63α可在转录水平直接抑制LIF的表达,并通过抑制Lnc-LIF-AS的表达间接抑制LIF的表达。3.Lnc-LIF-AS通过与LIF mRNA的3’端的重叠区,吸附可能降解LIF的非编码RNA,促进LIF基因的表达。结论1.ΔNP63α通过下调Lnc-LIF-AS来间接抑制LIF的表达;2.ΔNP63α通过直接结合作用抑制LIF的转录,3.Lnc-LIF-AS与LIF mRNA的3’端UTR区重叠,吸附可能降解LIF的非编码RNA,促进LIF基因的表达。

关键词：子宫颈癌 ΔNP63α LncRNA 白血病抑制因子

小干扰RNA抑制ΔNP63α表达对人食管鳞癌细胞生物学特性的影响

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第二军医大学学报 2013年第8期34卷 813-818页

作者：李白翎杜大海张冠鑫徐志云第二军医大学长海医院胸心外科上海 200433 第二军医大学长海医院实验诊断科上海 200433

目的通过腺相关病毒介导的小干扰RNA(siRNA)抑制人食管鳞癌细胞Eca109中ΔNP63α的表达,观察其对食管鳞癌细胞生物学特性的影响。方法构建H1启动子驱动的表达针对ΔNP63α的siRNA重组腺相关病毒AAV-ΔNP63αshRNA并感染Eca109细胞。同... 详细信息

目的通过腺相关病毒介导的小干扰RNA(siRNA)抑制人食管鳞癌细胞Eca109中ΔNP63α的表达,观察其对食管鳞癌细胞生物学特性的影响。方法构建H1启动子驱动的表达针对ΔNP63α的siRNA重组腺相关病毒AAV-ΔNP63αshRNA并感染Eca109细胞。同时以感染空腺相关病毒AAV-Null的细胞及不加腺相关病毒的细胞分别作为对照组和空白对照组,观察siRNA干扰ΔNP63α表达在体外及体内对Eca109细胞生长、增殖、致瘤及凋亡的影响。结果与对照组和空白对照组比较,Eca109细胞感染AAV-ΔNP63αshRNA后ΔNP63α蛋白表达下降(P均ΔNP63α的表达,减慢肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长。

关键词： ΔNP63α 食管肿瘤鳞状细胞肿瘤 Eca109细胞株腺相关病毒 RNA干扰