ΔNp63α对下咽鳞状细胞癌上皮—间质转化的作用研究

作     者：周梦燕 

作者单位：第二军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郑宏良

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：下咽鳞状细胞癌 ΔNp63α 上皮间质转化 免疫组织化学 

摘      要：研究背景:下咽癌是常见的头颈部恶性肿瘤,在我国下咽癌发病率约为0.29/10万。而在欧美国家下咽癌约占头颈部恶性肿瘤的3%-5%,约94.9%的病理类型为鳞状细胞癌。由于肿瘤恶性程度高以及侵袭能力强,易发生局部或者远处转移,其预后极差,五年生存率在头颈部肿瘤中最低。为提高下咽鳞状细胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC)转移的早期诊治、改善病人临床预后,有必要研究HSCC发生发展和转移机制,探讨调控其迁移和侵袭的主要因素,可为临床诊治提供新的思路。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞的迁移和运动能力增加,从而转化成易发生侵袭和迁移的具有间质细胞特性的细胞,它是肿瘤发生转移的重要早期事件之一。EMT进程涉及的调控网络和蛋白较复杂,包括E-钙黏蛋白(E-cadherin)等上皮细胞标志蛋白和波形蛋白(Vimentin)等间质细胞标志蛋白。E-cadherin和Vimentin是肿瘤EMT最重要的指示蛋白。在EMT进程中,E-cadherin表达下调、Vimentin表达上调,提示肿瘤细胞向间充质表型转换,肿瘤发生了转移。p63是p53基因家族的一员,与p53在序列和结构上具有高度同源性,其在头颈部组织主要表达亚型为ΔNp63α,可通过竞争结合下游靶基因DNA结合位点的方式拮抗p63其他亚型和p53的生物学功能,在细胞增殖和凋亡等多个生理病理过程中发挥重要作用。目前多项研究证明ΔNp63α在头颈部恶性肿瘤中可调控增殖、耐药等方面,但其在HSCC中对迁移侵袭的主要方式EMT的调控未有相关研究。因此我们在本课题中通过多种实验技术在不同层面研究探讨ΔNp63α对HSCC的EMT调控作用。第一部分ΔNp63α在头颈部鳞癌细胞株中表达与EMT关系研究研究目的:研究在4株头颈部鳞癌细胞株(HNC030#13、TU212、FADU及CAL-27)中ΔNp63的主要表达亚型和表达水平及,各细胞EMT标志蛋白表达和细胞迁移侵袭能力水平,初步探讨ΔNp63α在头颈部鳞癌细胞株中对EMT调控关系。研究方法:在4株头颈部鳞癌细胞株中采用Real-time PCR、Western Blot实验检测ΔNp63α蛋白与EMT标志蛋白表达水平。采用细胞划痕修复实验检测头颈部鳞癌细胞株的细胞迁移能力。采用细胞侵袭实验检测头颈部鳞癌细胞株的细胞侵袭能力。研究结果:头颈部鳞癌中Δnp63主要表达的亚型为Δnp63α。下咽鳞癌细胞株hnc030#13中Δnp63α、e-cadherin几乎不表达,而头颈部鳞癌细胞胞株tu212两者高表达,差异具有统计学意义(p0.001)。Δnp63α表达较多的喉鳞癌细胞株tu212的迁移、侵袭能力较低,而Δnp63α未检测到明显表达的下咽鳞癌细胞株hnc030#13的迁移侵袭能力最为显著,差异具有统计学意义(p0.001)。结论:Δnp63α在头颈部鳞癌细胞株中可能抑制emt作用。第二部分Δnp63α重组慢病毒构建及其调控下咽鳞癌emt作用研究研究目的:研究下咽鳞癌细胞株中Δnp63α表达水平改变对细胞emt标志蛋白表达以及功能学方面的影响,探讨Δnp63α在下咽鳞癌中对细胞emt进程的调控作用。研究方法:采用构建Δnp63α过表达慢病毒转染下咽鳞癌细胞株hnc030#13并药物筛选构建稳转株。在稳转株中采用real-timepcr、westernblot实验检测Δnp63α蛋白与emt标志蛋白表达水平的改变。采用细胞划痕修复实验检测头颈部鳞癌细胞株的细胞迁移能力。采用细胞侵袭实验检测头颈部鳞癌细胞株的细胞侵袭能力。研究结果:lv-Δnp63α的hnc030#13细胞由长梭形的间充质细胞外形向鹅卵石样上皮细胞外形转变。过表达Δnp63α后出现emt标志蛋白e-cadherin明显表达增多,差异具有统计学意义(p0.01)。lv-Δnp63α的hnc030#13细胞迁移、侵袭能力明显下降(p0.001)。研究结论:Δnp63α在下咽鳞癌细胞株中表达可抑制肿瘤细胞emt的进程。第三部分Δnp63α及emt相关标志物在下咽鳞癌中的表达及相关性研究研究目的:探讨Δnp63α和上皮-间质转化相关分子标志物(e-cadherin、vimentin)在hscc组织中表达相关性及其临床意义。研究方法:收集第二军医大学长海医院耳鼻咽喉头颈外科2013年1月至2016年11月收治的98例hscc患者的肿瘤组织及癌旁组织标本。采用免疫组织化学法检测各类组织及肿瘤不同区域中Δnp63α、e-cadherin、vimentin蛋白的表达水平,采用spearmen等级相关检验分析各蛋白表达的相关性,采用秩和检验比较各蛋白表达水平与患者临床病理特征的相关性。研究结果:在肿瘤组织中,Δnp63α与e-cadherin的表达呈正相关(p0.01,rs=0.409),与vimentin的表达呈负相关(p0.05,rs=-0.333)。与肿瘤中央区相比,肿瘤边缘区可见Δnp63α、e-cadherin的阳性表达程度下降,vimentin的阳性表达程度上升(P均0.05)。与ΔNp63α表达呈正相关的E-cadherin、与ΔNp63α表达呈正相关呈负相关Vimentin蛋白表达与肿瘤病理分化程度及淋巴结转移相关(P0.05)。研究结论:ΔNp63α在HSCC中对EMT具有抑制作用。