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鸭源呼肠孤病毒感染引起雏鸭免疫损伤的观察

中国农业科学 2010年第21期43卷 4514-4520页

作者：李爽谷长勤白家媛张红张万坡程国富胡薛英华中农业大学动物医学院

【目的】观察鸭源呼肠孤病毒对雏鸭脾、法氏囊的病理损伤及相关免疫指标,初步阐明鸭源呼肠孤病毒对所引起的机体免疫器官损伤以及机体免疫抑制,为进一步探讨发病机理和免疫防治提供理论依据。【方法】7日龄樱桃谷雏鸭人工感染鸭源呼肠... 详细信息

【目的】观察鸭源呼肠孤病毒对雏鸭脾、法氏囊的病理损伤及相关免疫指标,初步阐明鸭源呼肠孤病毒对所引起的机体免疫器官损伤以及机体免疫抑制,为进一步探讨发病机理和免疫防治提供理论依据。【方法】7日龄樱桃谷雏鸭人工感染鸭源呼肠孤病毒,分别观察脾、法氏囊组织病理学变化,检测脾、法氏囊指数,外周血CD3+、CD8+T细胞阳性率,脾、法氏囊IgY生成细胞,并分析试验组及对照组差异显著性。【结果】感染鸭源呼肠孤病毒后,雏鸭脾出现明显坏死灶,之后出现肉芽肿结构,法氏囊固有层淋巴滤泡明显减少;脾、法氏囊指数降低;外周血CD3+、CD8+T细胞阳性率降低;脾IgY生成细胞数量增多、法氏囊IgY生成细胞数量减少。【结论】鸭源呼肠孤病毒感染可导致雏鸭免疫器官严重损伤并引起免疫抑制。

关键词：鸭源呼肠孤病毒病理变化免疫损伤免疫抑制

鸭源呼肠孤病毒Sigma A蛋白的原核表达及免疫活性检测

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中国预防兽医学报 2013年第10期35卷 849-851页

作者：朱英奇陈宗艳李传峰孟春春王桂军刘光清安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

为制备新型鸭源呼肠孤病毒(DRV)TH11株Sigma A蛋白的多克隆抗体,本研究采用RT-PCR方法扩增DRV TH11株Sigma A的编码基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。采用SDS-PAGE和western blot对表达产... 详细信息

为制备新型鸭源呼肠孤病毒(DRV)TH11株Sigma A蛋白的多克隆抗体,本研究采用RT-PCR方法扩增DRV TH11株Sigma A的编码基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。采用SDS-PAGE和western blot对表达产物进行鉴定。结果表明,Sigma A基因不仅可以在大肠杆菌中高水平表达,表达产物的分子量约66 ku,而且表达产物能够被特异性DRV多克隆抗体识别,证明表达的Sigma A蛋白具有良好的免疫活性。以纯化的Sigma A蛋白免疫实验兔制备抗Sigma A蛋白的多克隆抗体,间接ELISA检测结果显示其效价达1∶20 000以上。间接免疫荧光试验表明,多克隆抗体能够特异性识别DRV的Sigma A蛋白,表明Sigma A蛋白具有良好的免疫原性。本研究为进一步研究Sigma A蛋白的功能,以及建立DRV检测方法奠定了基础。

关键词：鸭源呼肠孤病毒 Sigma A基因原核表达免疫原

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鸭源呼肠孤病毒对雏鸭致病性研究

中国兽医学报 2015年第3期35卷 350-354页

作者：张颖刁有祥高明葛平萍孙晓艳鲁爱玲山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 四川省绵阳农业学校四川绵阳621000 四川省绵阳市游仙区畜牧兽医局四川绵阳621000

30只10日龄樱桃谷肉鸭随机平均分为试验组和对照组,试验组静脉接种分离的鸭源呼肠孤病毒(DRV)SDWF株,每只0.2mL(ELD50=10-2.36/0.2mL),对照组每只静脉接种0.2mL生理盐水。于感染后3、6、9、12、15d每组随机抽取3只采血,利用流式细胞术... 详细信息

30只10日龄樱桃谷肉鸭随机平均分为试验组和对照组,试验组静脉接种分离的鸭源呼肠孤病毒(DRV)SDWF株,每只0.2mL(ELD50=10-2.36/0.2mL),对照组每只静脉接种0.2mL生理盐水。于感染后3、6、9、12、15d每组随机抽取3只采血,利用流式细胞术分析外周血CD4+/CD8+比值变化,并测定血清中IL-6及INF-γ含量以及免疫器官指数,同时观察试验组鸭临床症状、剖检变化及病理组织学变化。结果显示,攻毒后3d,试验组雏鸭表现精神沉郁,食欲不振,生长发育缓慢,体质量下降。剖检变化表现为脾脏出血、肿大、坏死,肝脏坏死。病理组织学变化表现为脾脏、法氏囊淋巴细胞流失严重,网状纤维显现;脾脏坏死,形成肉芽肿,血管动脉管壁疏松、增厚。攻毒后3d,外周血CD4+/CD8+比值升高,随后于攻毒后6、9d开始迅速下降,显著低于对照组(P鸭感染DRV的主要靶器官,免疫器官淋巴细胞流失严重,T细胞数量减少,IL-6、IFN-γ分泌量降低,从而导致机体免疫抑制。

关键词：鸭源呼肠孤病毒雏鸭致病性

鸭源呼肠孤病毒致BHK-21细胞凋亡的研究

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鸭源呼肠孤病毒致BHK-21细胞凋亡的研究

作者：逯艳云华中农业大学

学位级别：硕士

本试验采用细胞培养术、RT-PCR技术、光镜、电镜、荧光定量RT-PCR、TUNEL和流式细胞术等多种研究方法,对近几年来湖北省鸭源呼肠孤病毒分离株(Duck Reovirus, DRV) JZ061214株、HP080421株、HP081122株、HP09318株和YM101120株感染BHK-2... 详细信息

本试验采用细胞培养术、RT-PCR技术、光镜、电镜、荧光定量RT-PCR、TUNEL和流式细胞术等多种研究方法,对近几年来湖北省鸭源呼肠孤病毒分离株(Duck Reovirus, DRV) JZ061214株、HP080421株、HP081122株、HP09318株和YM101120株感染BHK-21细胞后细胞的病理变化特点、基因结构特点、病毒增殖状况和诱导细胞凋亡情况等作了系统的研究。 DRV感染BHK-21细胞的病理变化情况：攻毒后24h,细胞开始出现病变,表现为有的细胞圆缩,溶解、碎裂,攻毒48h后,病变逐渐加重,圆缩细胞越来越多,并可见悬浮的巨细胞,攻毒72h后,大量死亡细胞悬浮于培养液中。细胞经H.E染色,显微镜观察可见：部分细胞死亡,感染细胞核固缩、碎裂,且出现嗜酸性包涵体和合胞体。感染DRV的BHK-21被收集用来制作超薄切片,电镜下可观察到大小不一的空泡,同时,细胞质中呈现晶格状排列的病毒颗粒,病毒在细胞质增殖、复制,通过细胞崩解释放出来。 DRV感染BHK-21后的增殖情况：于接种病毒后1-72h七个时间段分别进行收毒,用荧光定量RT-PCR法检测所获病毒含量。结果表明,HP080421株、YM101120株和JZ061214株于攻毒后1～12h病毒含量较低,且呈上升趋势;JZ061214株、HP080421株和HP09318株于攻毒后24-72h病毒含量亦呈上升趋势;4株DRV病毒含量均于攻毒后72h达到高峰。 DRV感染BHK-21细胞后流式细胞仪检测细胞凋亡情况：HP09318和HP080421凋亡高峰出现在攻毒后3h,YM101120的凋亡高峰在攻毒后6h,而JZ061214出现在12h;它们的凋亡高峰时间有所不同,但均集中在攻毒后3-12h。且随着攻毒时间的延长,后期死亡细胞数呈增长趋势。 DRV感染BHK-21细胞后TUNEL检测细胞凋亡结果：4株DRV均于攻毒后3h检测到了比对照组多的凋亡阳性细胞,这些细胞的核都被染成棕黄色,随着死亡细胞数的增加,凋亡的阳性细胞数递减。这一凋亡情况与流式细胞仪检测的结果基本一致。 DRVS组基因扩增情况：对五株DRV S2、S3和S4基因进行扩增,分别扩增出1251bp、1104bp、1104bp的片段。测序结果通过进化树分析：五株分离株的S2基因与NP03和GZ/CHN/2007的遗传进化关系最近,分属同一分支,五株分离株的S3基因与GZ/CHN/2007遗传关系最近,分属同一分支,其中HP09318、HP081122、JZ061214、YM101120与HP080421属同一亚系;五株分离株的S4基因与GZ/CHN/2007遗传进化关系最近,分属同一进化分支;五株DRVS2基因之间的同源性高达98～100%,与DRV GZ/CHN/2007株同源性高达99%,与MDRV S12株同源性高达95%,与GRV03G株同源性高达97%,与所有ARV毒株的同源性都低,范围在77%～78%间;五株DRV S3基因之间的同源性为98-100%,与DRVNP03株同源性高达99%,与DRV091株同源性高达98%,与GZ/CHN/2007同源性高达97%,与MDRV03G株同源性高达95%,与ARV毒株的同源性也较低;五株DRV S4基因之间的同源性类似于S2基因的表现情况。

关键词：鸭源呼肠孤病毒 BHK-21细胞细胞凋亡 S组基因

鸭源呼肠孤病毒荧光定量RT-PCR方法的建立与应用

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鸭源呼肠孤病毒荧光定量RT-PCR方法的建立与应用

作者：杨旭华中农业大学

学位级别：硕士

禽呼肠孤病毒可以通过自然和人工感染鸡、火鸡、鸭、鹅等禽类,在世界范围内广泛流行。国内外多位学者从多种病禽体内分离到呼肠孤病毒,研究发现不同种禽类感染呼肠孤病毒后所表现的临床症状、病理变化有显著差异,给该病的诊断带来了极... 详细信息

禽呼肠孤病毒可以通过自然和人工感染鸡、火鸡、鸭、鹅等禽类,在世界范围内广泛流行。国内外多位学者从多种病禽体内分离到呼肠孤病毒,研究发现不同种禽类感染呼肠孤病毒后所表现的临床症状、病理变化有显著差异,给该病的诊断带来了极大困难。我国主要肉鸭养殖地区均报道鸭源呼肠孤病毒感染严重并造成巨大的经济损失。因此,寻找一种先进的技术来快速、准确、灵敏的检测鸭源呼肠孤病毒已经成为该病诊断、治疗的迫切需要和必然趋势。本试验根据GenBank中鸭源呼肠孤病毒S2基因序列中的保守序列设计一对特异性引物,在建立鸭源呼肠孤病毒荧光定量RT-PCR的基础上,应用此方法检测该病毒在不同组织内的分布与含量,对阐明该病发病机理,疾病的预防与诊断以及流行病学调查具有重要的意义。主要研究内容如下：1.阳性标准品的制备根据鸭源呼肠孤病毒S2基因区域中的保守序列,设计并合成了一对可以扩增285bp的引物,扩增目的片段。然后将此目的基因克隆到pMD18-T载体中,将重组子转入大肠杆菌DH5a中,经过PCR鉴定和测序鉴定,筛选出重组阳性质粒,命名为pMD18-TS2。用核酸蛋白仪进行质粒纯度和浓度的测定,检测三次后取平均值。将质粒浓度通过公式换算成拷贝数为1.48×1010copies/μL。定量后,将其10倍梯度稀释至1.48×100opies/μL2.荧光定量RT-PCR方法的建立与优化以阳性质粒pMD18-TS2为模板,通过对退火温度和引物浓度等的优化,使整个反应达到最佳。按照优化的反应条件,以定量的10倍梯度稀释的质粒标准品为模板进行扩增和标准曲线的建立。结果显示,各浓度质粒标准品的扩增曲线间呈现良好的梯度分布,标准曲线的Ct值和起始模板拷贝数在1.48×109拷贝～1.48×101拷贝间具有良好的线性关系。线性回归方程函数表达式为Y--3.444X+39.344(X代表起始模板拷贝数的对数,Y代表Ct值),Ct值与起始模板的拷贝数的相关性为0.998,而且反应的扩增效率可达95.16%。另外特异性试验表明此方法对鸭源呼肠孤病毒的检测特异性强,与鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭疫里默氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、鸭源沙门氏菌等无交叉反应。对高、中、低不同浓度质粒标准品检测的批内重复变异系数为0.94%-3.57%,批间重复变异系数为1.12%-5.61%,显示出良好的重复性。3.常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR的比较对收集的80份人工感染样品和10份临床样品分别用常规RT-PCR和本文建立的荧光定量RT-PCR方法进行检测。结果显示,人工感染的样品组织中,荧光定量RT-PCR检出率(52.5%)高于常规RT-PCR(45%)。荧光定量RT-PCR结果显示,在人工感染雏鸭收集的8种组织中,均能检测到病毒存在。脾、法氏囊、胸腺和肺脏的检出率较高,而肝脏、胰脏检出率较低。单因素方差分析结果显示,脾脏组的病毒含量高于其它组病毒含量(P鸭源呼肠孤疾病的快速诊断提供准确、灵敏、特异性的方法。病鸭脾脏为检测病原的优选器官。

关键词：鸭源呼肠孤病毒荧光定量RT-PCR 检测分布与含量

鸭疫里默氏杆菌与鸭源呼肠孤病毒混合感染的病理学诊断

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中国兽医科学 2019年第9期49卷 1194-1198页

作者：焦哲宋彦民孙秀秀刘晓丽谷长勤程国富张万坡胡薛英华中农业大学动物医学院湖北武汉430070

为确诊湖北省某鸭场自然发病的13日龄雏蛋鸭的死亡原因,对送检的7只病鸭进行了临床症状观察、病理剖检、细菌分离鉴定、病毒PCR/RT-PCR检测和组织病理学分析。结果显示,病鸭临床症状为头肿大流泪,脚软,共济失调,排白色稀便。病理剖检观... 详细信息

为确诊湖北省某鸭场自然发病的13日龄雏蛋鸭的死亡原因,对送检的7只病鸭进行了临床症状观察、病理剖检、细菌分离鉴定、病毒PCR/RT-PCR检测和组织病理学分析。结果显示,病鸭临床症状为头肿大流泪,脚软,共济失调,排白色稀便。病理剖检观察到病鸭有严重的全身浆膜纤维素性渗出和脾坏死,法氏囊、胸腺萎缩;分离细菌的培养鉴定结果为革兰阴性短杆菌,16S rRNA测序结果鉴定该分离菌株为鸭疫里默氏杆菌,药敏试验得出该分离菌对头孢类和阿莫西林等敏感;通过病毒特异性引物扩增出鸭呼肠孤病毒条带;组织病理学观察见纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎,脾坏死,胸腺和法氏囊淋巴细胞减少。综合以上研究结果,表明该批鸭是由鸭疫里默氏杆菌与鸭源呼肠孤病毒混合感染而导致大量发病死亡的。

关键词：鸭疫里默氏杆菌鸭源呼肠孤病毒混合感染病理学观察

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鸭源呼肠孤病毒感染影响番鸭肠道菌群的组成

鸭源呼肠孤病毒感染影响番鸭肠道菌群的组成

商品肉鸭免疫抑制病病原体共感染情况调查及鸭源呼肠孤病毒的致病性研究

第九届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：陈秀琴郑敏林锋强陈仕龙程晓霞陈少莺福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心

引言鸭源呼肠孤病毒属于呼肠孤病毒科的正呼肠孤病毒属,包括番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus,MDRV）和新型鸭呼肠孤病毒（Novel duckreovirus,NDRV）。自1997年以来,福建、浙江和浙江等地的番鸭相继发生番鸭呼肠孤病毒病。该病... 详细信息

引言鸭源呼肠孤病毒属于呼肠孤病毒科的正呼肠孤病毒属,包括番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus,MDRV）和新型鸭呼肠孤病毒（Novel duckreovirus,NDRV）。自1997年以来,福建、浙江和浙江等地的番鸭相继发生番鸭呼肠孤病毒病。该病仅感染番鸭,发病日龄为7～45日龄,临床上以软脚、水样腹泻为主要症状,肝、脾表面有大量灰白色坏死点。该病的病死率为60%～80%。2005年,在中国暴发另一种鸭源呼肠孤病毒病,为了与番鸭呼肠孤病毒病区别,该病命名为新型鸭呼肠孤病毒病。

关键词：鸭源呼肠孤病毒新型鸭呼肠孤病毒肠道菌群

来源： cnki会议评论

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商品肉鸭免疫抑制病病原体共感染情况调查及鸭源呼肠孤病毒的致病...

作者：张颖山东农业大学

学位级别：硕士

禽流感病毒（Avian Influenza virus，AIV）、禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus,aMPV）、鸭源呼肠孤病毒（Duck Reovirus， DRV）、禽网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosisvirus， REV）、鸭圆环病毒（Duck Circovirus， DuCV）、传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease, IBDV）是鸭群中常见的免疫抑制病病原，可以诱导机体中枢淋巴器官的淋巴细胞凋亡，影响细胞免疫和体液免疫，从而产生免疫抑制，造成鸭群死亡和淘汰。从山东省不同地区采集病、死肉鸭397份以及健康肉鸭200份，用特异性核酸探针对样品进行H9N2禽流感病毒（H9N2AIV）、禽偏肺病毒（aMPV）、呼肠孤病毒（DRV）、鸭圆环病毒（DuCV）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）、禽网状内皮组织增生症病毒（REV）的检测。结果，自然发病肉鸭中H9N2AIV、aMPV、DRV、REV、DuCV、IBDV检出率分别为57.43%、51.39%、38.54%、39.55%、29.47%、10.58%，且存在多重感染现象，二重和三重感染率分别为26.20%、18.89%，以aMPV和H9N2AIV、REV和DuCV检出率较高;而健康肉鸭群中H9N2AIV、aMPV、DRV、REV、DuCV、IBDV检出率均分别为7.00%、19.5%、15.5%、10.5%、24.00%、9.00%，呈阴性的和单一感染的样品分别占40.00%和28.00%;共感染率为32.00%，且主要是二重感染。上述结果表明，商品肉鸭群中普遍存在免疫抑制病病原体共感染的现象，这是当前肉鸭发病和生长缓慢的重要流行病学因素之一。利用一株分离的鸭源呼肠孤病毒（DuckAvian Reovirus，DRV），经静脉接种雏鸭，探讨其对雏鸭的致病性。将30只10日龄健康的樱桃谷肉鸭随机分为攻毒组和对照组，攻毒组静脉接种DRV，攻毒剂量为0.2mL/只（ELD50为10-2.36/0.2mL），对照组以相同的攻毒方式接种0.2mL灭菌的生理盐水，两组分别隔离饲养。攻毒后3、6、9、12、15d，每组随机抽取3只活鸭采血，进行血液常规和血液生化指标检测;利用流式细胞术分析外周血CD4+/CD8+比值动态变化;将采集的血液分离血清，测定血清中IL-6及INF-γ含量;并称重剖杀，观察剖检变化，分离脾脏、胸腺、法氏囊称重，计算免疫器官指数，并进行病理组织学检查，在整个试验期间观察试验组鸭发病情况及临床症状。攻毒3d后，试验组雏鸭表现精神沉郁，聚集成堆，食欲不振，生长发育缓慢，体重下降。剖检变化表现为脾脏出血肿大、坏死，肝脏坏死;病理组织学变化主要表现为免疫器官和血管系统的损害，脾脏、法氏囊淋巴细胞丢失严重，网状纤维显现，脾脏坏死，形成肉芽肿，动脉血管管壁疏松、增厚，水肿，空泡变性。血常规指标WBC、RBC、HGB升高，在攻毒后第9、12、15d，试验组WBC显著高于对照组（P<0.05），试验组HGB在攻毒后整个时间点均显著高于对照组（P<0.05）;攻毒后第9d，血生化指标GPT开始升高，并在9d，12d，15d均显著高于对照组（P<0.05），试验组BUN在攻毒后9、12、15d显著高于对照组（P<0.05），而ALB在攻毒后第3d显著低于对照组（P<0.05），攻毒后期与TP均表现升高的趋势;攻毒后第3d，外周血CD4+/CD8+比值升高，但与对照组差异不显著，在攻毒后第6d、9d开始迅速下降，显著低于对照组（P<0.05），后期虽然有所回升，但是CD4+/CD8+比值仍然低于对照组;血清中IL-6、IFN-γ含量变化规律与外周血CD4+/CD8+比值变化规律相似，于攻毒后第9d均显著低于对照组(P<0.05);脾脏、法氏囊指数均在攻毒后第6d显著低于对照组(P<0.05)，脾脏指数在整个试验观察期间均高于对照组。结果表明，感染DRV后，脾脏、法氏囊的淋巴细胞流失严重，T细胞数量减少，细胞因子IL-6、IFN-γ分泌减少，导致机体免疫抑制。

关键词：鸭免疫抑制病原共感染点杂交鸭源呼肠孤病毒致病性

一株新型鸭源呼肠孤病毒(TH11株)的分离与鉴定

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中国动物传染病学报 2012年第1期20卷 10-15页

作者：陈宗艳朱英奇王世传李传峰李露王玢缤付玉志高景鹏王超刘光清中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 安徽省全椒县畜牧兽医局全椒239500

本文从太湖流域某养鸭场分离到一株呼肠孤病毒(Duck reovirus,DRV)TH11株,该病毒感染的病鸭主要表现软脚和拉稀等主要症状,剖检病变以肝脏出血和脾脏坏死为主要特征。电镜鉴定结果显示,该病原具有呼肠孤病毒的典型形态学特征。动物回归... 详细信息

本文从太湖流域某养鸭场分离到一株呼肠孤病毒(Duck reovirus,DRV)TH11株,该病毒感染的病鸭主要表现软脚和拉稀等主要症状,剖检病变以肝脏出血和脾脏坏死为主要特征。电镜鉴定结果显示,该病原具有呼肠孤病毒的典型形态学特征。动物回归试验和RT-PCR扩增结果证明,该株病毒无论是在致病性方面,还是在基因序列方面都不同于以往的番鸭呼肠孤病毒,而是一株对多品种鸭具有较高致病性和病死率的新型鸭呼肠孤病毒。

关键词：鸭源呼肠孤病毒动物回归试验电镜 RT-PCR