鸭源呼肠孤病毒荧光定量RT-PCR方法的建立与应用

作     者：杨旭 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：程国富;胡薛英

授予年度：2011年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：鸭源呼肠孤病毒 荧光定量RT-PCR 检测 分布与含量 

摘      要：禽呼肠孤病毒可以通过自然和人工感染鸡、火鸡、鸭、鹅等禽类,在世界范围内广泛流行。国内外多位学者从多种病禽体内分离到呼肠孤病毒,研究发现不同种禽类感染呼肠孤病毒后所表现的临床症状、病理变化有显著差异,给该病的诊断带来了极大困难。我国主要肉鸭养殖地区均报道鸭源呼肠孤病毒感染严重并造成巨大的经济损失。因此,寻找一种先进的技术来快速、准确、灵敏的检测鸭源呼肠孤病毒已经成为该病诊断、治疗的迫切需要和必然趋势。本试验根据GenBank中鸭源呼肠孤病毒S2基因序列中的保守序列设计一对特异性引物,在建立鸭源呼肠孤病毒荧光定量RT-PCR的基础上,应用此方法检测该病毒在不同组织内的分布与含量,对阐明该病发病机理,疾病的预防与诊断以及流行病学调查具有重要的意义。主要研究内容如下： 1.阳性标准品的制备根据鸭源呼肠孤病毒S2基因区域中的保守序列,设计并合成了一对可以扩增285bp的引物,扩增目的片段。然后将此目的基因克隆到pMD18-T载体中,将重组子转入大肠杆菌DH5a中,经过PCR鉴定和测序鉴定,筛选出重组阳性质粒,命名为pMD18-TS2。用核酸蛋白仪进行质粒纯度和浓度的测定,检测三次后取平均值。将质粒浓度通过公式换算成拷贝数为1.48×1010copies/μL。定量后,将其10倍梯度稀释至1.48×100opies/μL 2.荧光定量RT-PCR方法的建立与优化以阳性质粒pMD18-TS2为模板,通过对退火温度和引物浓度等的优化,使整个反应达到最佳。按照优化的反应条件,以定量的10倍梯度稀释的质粒标准品为模板进行扩增和标准曲线的建立。结果显示,各浓度质粒标准品的扩增曲线间呈现良好的梯度分布,标准曲线的Ct值和起始模板拷贝数在1.48×109拷贝～1.48×101拷贝间具有良好的线性关系。线性回归方程函数表达式为Y--3.444X+39.344(X代表起始模板拷贝数的对数,Y代表Ct值),Ct值与起始模板的拷贝数的相关性为0.998,而且反应的扩增效率可达95.16%。另外特异性试验表明此方法对鸭源呼肠孤病毒的检测特异性强,与鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭疫里默氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、鸭源沙门氏菌等无交叉反应。对高、中、低不同浓度质粒标准品检测的批内重复变异系数为0.94%-3.57%,批间重复变异系数为1.12%-5.61%,显示出良好的重复性。 3.常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR的比较对收集的80份人工感染样品和10份临床样品分别用常规RT-PCR和本文建立的荧光定量RT-PCR方法进行检测。结果显示,人工感染的样品组织中,荧光定量RT-PCR检出率(52.5%)高于常规RT-PCR(45%)。荧光定量RT-PCR结果显示,在人工感染雏鸭收集的8种组织中,均能检测到病毒存在。脾、法氏囊、胸腺和肺脏的检出率较高,而肝脏、胰脏检出率较低。单因素方差分析结果显示,脾脏组的病毒含量高于其它组病毒含量(P0.05)。在检测的10个临床样品中,荧光定量RT-PCR检出率(60%)仍高于常规RT-PCR(30%)。 研究结果表明：建立的荧光定量RT-PCR方法可以为鸭源呼肠孤疾病的快速诊断提供准确、灵敏、特异性的方法。病鸭脾脏为检测病原的优选器官。