鸭源呼肠孤病毒致BHK-21细胞凋亡的研究

作     者：逯艳云 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：胡薛英

授予年度：2013年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：鸭源呼肠孤病毒 BHK-21细胞 细胞凋亡 S组基因 

摘      要：本试验采用细胞培养术、RT-PCR技术、光镜、电镜、荧光定量RT-PCR、TUNEL和流式细胞术等多种研究方法,对近几年来湖北省鸭源呼肠孤病毒分离株(Duck Reovirus, DRV) JZ061214株、HP080421株、HP081122株、HP09318株和YM101120株感染BHK-21细胞后细胞的病理变化特点、基因结构特点、病毒增殖状况和诱导细胞凋亡情况等作了系统的研究。 DRV感染BHK-21细胞的病理变化情况：攻毒后24h,细胞开始出现病变,表现为有的细胞圆缩,溶解、碎裂,攻毒48h后,病变逐渐加重,圆缩细胞越来越多,并可见悬浮的巨细胞,攻毒72h后,大量死亡细胞悬浮于培养液中。细胞经H.E染色,显微镜观察可见：部分细胞死亡,感染细胞核固缩、碎裂,且出现嗜酸性包涵体和合胞体。感染DRV的BHK-21被收集用来制作超薄切片,电镜下可观察到大小不一的空泡,同时,细胞质中呈现晶格状排列的病毒颗粒,病毒在细胞质增殖、复制,通过细胞崩解释放出来。 DRV感染BHK-21后的增殖情况：于接种病毒后1-72h七个时间段分别进行收毒,用荧光定量RT-PCR法检测所获病毒含量。结果表明,HP080421株、YM101120株和JZ061214株于攻毒后1～12h病毒含量较低,且呈上升趋势;JZ061214株、HP080421株和HP09318株于攻毒后24-72h病毒含量亦呈上升趋势;4株DRV病毒含量均于攻毒后72h达到高峰。 DRV感染BHK-21细胞后流式细胞仪检测细胞凋亡情况：HP09318和HP080421凋亡高峰出现在攻毒后3h,YM101120的凋亡高峰在攻毒后6h,而JZ061214出现在12h;它们的凋亡高峰时间有所不同,但均集中在攻毒后3-12h。且随着攻毒时间的延长,后期死亡细胞数呈增长趋势。 DRV感染BHK-21细胞后TUNEL检测细胞凋亡结果：4株DRV均于攻毒后3h检测到了比对照组多的凋亡阳性细胞,这些细胞的核都被染成棕黄色,随着死亡细胞数的增加,凋亡的阳性细胞数递减。这一凋亡情况与流式细胞仪检测的结果基本一致。 DRVS组基因扩增情况：对五株DRV S2、S3和S4基因进行扩增,分别扩增出1251bp、1104bp、1104bp的片段。测序结果通过进化树分析：五株分离株的S2基因与NP03和GZ/CHN/2007的遗传进化关系最近,分属同一分支,五株分离株的S3基因与GZ/CHN/2007遗传关系最近,分属同一分支,其中HP09318、HP081122、JZ061214、YM101120与HP080421属同一亚系;五株分离株的S4基因与GZ/CHN/2007遗传进化关系最近,分属同一进化分支;五株DRVS2基因之间的同源性高达98～100%,与DRV GZ/CHN/2007株同源性高达99%,与MDRV S12株同源性高达95%,与GRV03G株同源性高达97%,与所有ARV毒株的同源性都低,范围在77%～78%间;五株DRV S3基因之间的同源性为98-100%,与DRVNP03株同源性高达99%,与DRV091株同源性高达98%,与GZ/CHN/2007同源性高达97%,与MDRV03G株同源性高达95%,与ARV毒株的同源性也较低;五株DRV S4基因之间的同源性类似于S2基因的表现情况。