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人成纤维细胞饲养层的制备及其对胚胎干细胞生长支持作用

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复旦学报（医学版） 2008年第5期35卷 654-660页

作者：米蔷何志旭段茂利王志华杨燕贵阳医学院干细胞研究中心-贵阳医学附属医院儿科贵州贵阳550004 瑞典卡罗琳斯卡医科大学临床神经科学部瑞典斯德哥尔摩17176

目的为建立不含动物细胞成分的人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESc)体外培养系统,用人包皮成纤维细胞(human postnatal foreskin fibroblasts,hPFF)制备细胞饲养层并观察其对hESc体外生长的支持功能及生物学特性的维持作用。... 详细信息

目的为建立不含动物细胞成分的人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESc)体外培养系统,用人包皮成纤维细胞(human postnatal foreskin fibroblasts,hPFF)制备细胞饲养层并观察其对hESc体外生长的支持功能及生物学特性的维持作用。方法利用儿童阴茎包皮环切术后遗弃包皮组织分离培养成纤维细胞,纯化增殖细胞,采用35Gyγ射线照射灭活法制备成饲养层。将hESc(HS181细胞株)接种在该饲养层上,连续传代至20代,倒置显微镜观察其形态学变化,测定其细胞碱性磷酸酶活性,类胚体形成实验及干细胞转录因子表达,严重联合免疫缺陷的小鼠(severe combined immune deficiency mice,SCID)体内畸胎瘤形成及体内全能分化特性实验对hESc生物学特性进行鉴定。结果hPFF体外培养过程中生长增殖旺盛,连续传20代以上能保持正常细胞形态学和生物学特性。经γ射线照射使其停止增殖,24 h内能较好地保持细胞活力和形态学特征,具备饲养层细胞基本条件。HS181 hESc在hPFF上传到20代仍能较好地保持未分化状态,细胞呈克隆性生长,高度表达碱性磷酸酶及Oct-4、Nanog等胚胎干细胞转录因子;悬浮法培养连续传20代的hESc可获得由3个胚层细胞所形成的类胚体(Embryoid bodies,EB)结构,可检测到CD90、Flt-1、Nestin基因的表达,证明得到的类胚体中含了3个胚层细胞,说明hESc具有体外多能干性特征。体内全能分化实验显示:将第20代的hESc接种到SCID小鼠体内,6周后可形成畸胎瘤,组织学切片分析其包含了源于全部3个胚层的各种分化细胞,直接证明其具有体内多向分化的全能性。结论hPFF可作为一种来源丰富,取材方便的人源化饲养层细胞,能有效地支持hESc体外生长。克服了目前hESc建系和体外培养过程中使用动物细胞饲养层带来的异种蛋白污染和致病微生物的危险,初步解决了hESc临床应用的生物安全性问题。

关键词：胚胎干细胞成纤维细胞饲养层人类

饲养层细胞的接种密度对分离培养胚胎干细胞的影响

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中国兽医学报 2009年第4期29卷 494-501页

作者：赵晶董雅娟柏学进靳亚平张廷龙封纪武西北农林科技大学农业部家畜内分泌与胚胎工程重点开放实验室陕西杨凌712100 青岛农业大学动物胚胎工程中心山东青岛266109 山东小黑牛集团公司山东淄博255000

建立有效的昆明白小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)饲养层培养体系,用于分离和培养小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)的研究。(1)取怀孕14.5 d昆明白小鼠胎儿分离成纤维细胞,利用体外培养体系分离传代,选... 详细信息

建立有效的昆明白小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)饲养层培养体系,用于分离和培养小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)的研究。(1)取怀孕14.5 d昆明白小鼠胎儿分离成纤维细胞,利用体外培养体系分离传代,选取生长旺盛并且已纯化的P3代的MEF,经丝裂霉素处理后,用细胞计数板计算活细胞数,分别按1×104、1×106、1×108/mL密度接种,制备饲养层,观察不同密度饲养层的生长状况。(2)取怀孕4 d的昆明白小鼠囊胚,接种在不同密度饲养层上。观察不同密度饲养层上囊胚、ICM及ES细胞的克隆生长情况。结果显示:囊胚在密度为1×106/mL的饲养层上,贴壁率和ICM孵出率分别为(97.0±3.606)%和(96.3±2.887)%,显著高于其他2组;密度为1×106/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率高于密度为1×104/mL(差异极显著,P饲养层上的ES细胞克隆形成率(差异显著,P饲养层和1×108/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率差异不显著(P>0.05)。结果表明:以1×106/mL密度接种的MEF作为饲养层,最适合用于分离培养昆明白小鼠ES细胞,有利于囊胚的发育,ICM的增殖,促进ES细胞的增殖,并起到抑制其分化的作用。

关键词：昆明白小鼠胎儿成纤维细胞饲养层胚胎干细胞

饲养层FGF2表达量对猕猴胚胎干细胞自我更新及多能性的影响

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Zoological Research 2008年第4期29卷 405-414页

作者：张敬魏强卢斌陈永昌陈洪伟李荣荣王喜宏季维智中国科学院昆明动物研究所

用转基因和RNA干扰(RNAi)法建立5组不同成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF2)表达量的猕猴耳部皮肤成纤维细胞(MESF)系:过表达FGF2组(f1),过表达的阴性对照组(f2),FGF2RNA干扰组(f3),RNA干扰的阴性对照组(f4)和未作... 详细信息

用转基因和RNA干扰(RNAi)法建立5组不同成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF2)表达量的猕猴耳部皮肤成纤维细胞(MESF)系:过表达FGF2组(f1),过表达的阴性对照组(f2),FGF2RNA干扰组(f3),RNA干扰的阴性对照组(f4)和未作任何处理的对照组(f5)。5组MESF的FGF2表达量相对值为f1:f2:f3:f4:f5=4∶2∶1∶2∶2;c-fos,TGF-β1,INHBA,Gremlin1在f1中表达量上升,在f3中表达量下降;BMP4,TGF-β2在f1中表达量下降,在f3中表达量上升;表明内源FGF2能够作用于MESF的TGF-β信号通路,引起相关基因表达量的变化。用这些细胞作为饲养层长期培养(10代)猕猴胚胎干细胞(RhESC),结果在f1上培养的RhESC增殖速度都比对照组快,并且c-fos,TGF-β1,INHBA,Gremlin1,Oct-4,Nanog,Sox2表达量均上升,BMP4表达下调;在f3上培养的RhESC增殖较慢,BMP4表达上调,c-fos,TGF-β1,INHBA,Gremlin1,Oct-4,Nanog,Sox2表达下调。5组MESF上培养的RhESC形成的EB均表达各胚层早期标记基因(marker),说明RhESC的多能性没有受到影响,但表达量有差异,f1上RhESC形成的EB所有marker都低表达。结果表明饲养层的FGF2含量不仅影响自身相关基因的表达,还对RhESC的自我更新有一定的作用。

关键词：猕猴 FGF2 饲养层胚胎干细胞增殖

以转染白血病抑制因子基因的人胚肺成纤维细胞为饲养层培养人胚胎生殖细胞

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解剖学报 2007年第3期38卷 310-314页

作者：李芳菲刘永刚王建伟王莎莉王亚平重庆医科大学基础医学院组织学胚胎学教研室重庆400016

目的以转染白血病抑制因子(LIF)基因的人胚肺成纤维细胞为饲养层培养人胚胎生殖细胞,为建立无动物成分污染的人胚胎生殖细胞培养体系奠定基础。方法将LIF真核表达载体pcDNA3.1(+)-LIF转染到人胚肺成纤维细胞中,通过筛选和鉴定获得表达LI... 详细信息

目的以转染白血病抑制因子(LIF)基因的人胚肺成纤维细胞为饲养层培养人胚胎生殖细胞,为建立无动物成分污染的人胚胎生殖细胞培养体系奠定基础。方法将LIF真核表达载体pcDNA3.1(+)-LIF转染到人胚肺成纤维细胞中,通过筛选和鉴定获得表达LIF的阳性细胞。将原始生殖细胞(PGCs)种植到转染后细胞制备而成的饲养层上,在不添加外源性LIF的条件下培养,并对PGCs来源的细胞集落进行鉴定。结果经RT-PCR及Western blotting鉴定证实,转染pcDNA3.1(+)-LIF的人胚肺成纤维细胞表达LIF基因。在转染后人胚肺成纤维细胞上生长的PGCs可形成典型的鸟巢状集落,经检测集落碱性磷酸酶活性呈强阳性,表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81,及未分化标志Oct-4。结论用转染LIF基因后的人胚肺成纤维细胞作为饲养层能支持PGCs来源人胚胎生殖细胞的生长,维持自我更新。

关键词：人胚肺成纤维细胞白血病抑制因子饲养层逆转录聚合酶链反应免疫印迹法人胚胎生殖细胞

小鼠胰腺干细胞在胎鼠成纤维细胞饲养层条件下的体外连续传代培养(英文)

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中国组织工程研究与临床康复 2009年第40期13卷 7964-7968页

作者：岑妍慧广西中医学院组织学与胚胎学教研室广西壮族自治区南宁市530001

背景:胰腺干细胞具有分裂与高度分化潜能的特性,可以在体外进行成功分离和培养,但体外如何对其进行有效扩增是亟待解决的问题。目的:在胎鼠成纤维细胞饲养层条件下体外传代培养小鼠胰腺干细胞。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-... 详细信息

背景:胰腺干细胞具有分裂与高度分化潜能的特性,可以在体外进行成功分离和培养,但体外如何对其进行有效扩增是亟待解决的问题。目的:在胎鼠成纤维细胞饲养层条件下体外传代培养小鼠胰腺干细胞。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-07/2008-01在广西中医学院基础医学院细胞无菌培养室完成。材料:SPF级新生昆明小鼠20只,孕14d昆明小鼠多只,均购自广西中医学院实验动物中心。方法:取SPF级新生昆明小鼠的胰腺组织,Ⅴ型胶原酶消化,未消化完全的组织块自然沉降后,收集上层的含细胞离散液,离心弃上清,加入含角质细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的无血清低糖DMEM培养基,在经多聚赖氨酸溶液处理的24孔板中培养。取孕14d昆明小鼠,剖腹取胎鼠,去除头部及内脏,将躯干及四肢采用组织块胰蛋白酶消化法分离培养成纤维细胞,调整密度为5×108L-1接种于24孔板中,传至第3代经丝裂霉素适当处理制备饲养层细胞。取原代培养5d的胰腺干细胞,按30个/cm2密度种入铺有饲养层细胞的孔板中,当胰腺干细胞铺满小孔底部面积的80%时继续传代。主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态变化,原代培养48h对细胞进行碱性磷酸酶染色,通过免疫组织化学染色鉴定胰腺干细胞特异分子标志物巢蛋白的表达。分别于传代后2,3,4,5d检测碱性磷酸酶、巢蛋白和胰十二指肠同源盒基因1的表达。结果:原代培养的来源于胰腺组织的细胞中,可见一些大、圆、单个核的细胞,胞浆折光性强,核浆比例大,呈附壁生长,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达胰腺干细胞特异性分子标志巢蛋白,且具有活跃的分裂增殖能力。在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层条件下对胰腺干细胞进行体外传代培养,可连续传至第3代,各代胰腺干细胞仍保持大、圆、单个核、核浆比例大及增殖能力强等特性,传代后各时间点碱性磷酸酶、巢蛋白染色均呈阳性,胰十二指肠同源盒基因1蛋白染色呈阴性反应,可保持未分化状态。结论:以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,经丝裂霉素C处理后可分泌供胰腺干细胞生长所需的因子,并抑制胰腺干细胞的自主分化,体外连续传至第3代仍能够保持较好的生长特性、高度增殖能力及未分化状态。

关键词：胰腺干细胞胚胎成纤维细胞饲养层连续传代

人胚骨髓基质细胞饲养层对人胚胎生殖细胞生长的作用

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生殖与避孕 2005年第3期25卷 131-136页

作者：姜景岩孔北华刘星霞侯怀水马秀峰沈柏均时庆山东大学齐鲁医院济南250012

目的:研究人胚原代骨髓基质细胞(BMSC)饲养层对人胚胎生殖细胞(hEGC)生长的支持作用。方法:以非意愿妊娠流产胎儿股骨为材料制备BMSC饲养层;同时取胎儿组织分离培养人成纤维细胞,以成纤维细胞培养液上清制备条件培养液(CM)。另取13.5d... 详细信息

目的:研究人胚原代骨髓基质细胞(BMSC)饲养层对人胚胎生殖细胞(hEGC)生长的支持作用。方法:以非意愿妊娠流产胎儿股骨为材料制备BMSC饲养层;同时取胎儿组织分离培养人成纤维细胞,以成纤维细胞培养液上清制备条件培养液(CM)。另取13.5d胎鼠制备原代小鼠胎儿成纤维细胞(PMEF)饲养层。分组培养人原始生殖细胞:A组(PMEF饲养层)、B组(BMSC饲养层)、C组(CM)、D组(BMSC饲养层+CM),观察不同条件下hEGC生长增殖行为。结果:D组与A组均有利于支持人胚胎生殖细胞的体外生长,并保持其不分化的状态和多分化的潜能,两组比较无明显差异。单用B组可支持人胚胎生殖细胞的体外生长,但效率低于上述两组。单用条件培养液不能获得贴壁生殖细胞克隆。结论:BMSC饲养层+CM可支持hEGC的体外培养,且无异源性蛋白的污染,更有利于临床应用。

关键词：胚胎生殖细胞原始生殖细胞骨髓基质细胞饲养层

包皮成纤维细胞作为饲养层对人胚胎生殖细胞生长的影响

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解剖学报 2010年第6期41卷 876-879页

作者：黎晓莉王璐吴宏张雁关雪晶姜蓉重庆医科大学基础医学院组织学胚胎学教研室干细胞与组织工程研究室重庆400016

目的以人包皮成纤维细胞为饲养层体外培养人胚胎生殖细胞,观察饲养层对其生长的影响,并对人胚胎生殖细胞进行鉴定。方法分离培养4～5岁小儿包皮成纤维细胞,取P3～P30代细胞用丝裂霉素灭活后铺板备用,酶联免疫吸附测定(ELISA)-双抗夹心... 详细信息

目的以人包皮成纤维细胞为饲养层体外培养人胚胎生殖细胞,观察饲养层对其生长的影响,并对人胚胎生殖细胞进行鉴定。方法分离培养4～5岁小儿包皮成纤维细胞,取P3～P30代细胞用丝裂霉素灭活后铺板备用,酶联免疫吸附测定(ELISA)-双抗夹心法检测其分泌物成纤维细胞生长因子(FGF)的含量;分离培养5～11周人胚胎原始生殖细胞,在不添加任何细胞因子的人包皮成纤维细胞饲养层上培养人胚胎生殖细胞;细胞化学法检测人胚胎生殖细胞碱性磷酸酶的活性,免疫细胞化学法检测其胚胎表面特异性抗原SSEA-1及SSEA-4的表达,RT-PCR法检测Oct-4的表达。结果包皮成纤维细胞可以传60代以上,P3～P30代均适宜作饲养层;P3～P30代包皮成纤维细胞上清液中FGF含量在(172.09±2.66)pg/L～(245.25±1.66)pg/L之间波动。分离培养的人胚胎生殖细胞在饲养层上可形成典型的胚胎生殖细胞集落,体外连续培养超过3代,其碱性磷酸酶活性呈强阳性,集落未分化标志检测显示SSEA-l、SSEA-4呈阳性,Oct-4表达阳性。结论用人包皮成纤维细胞作为饲养层能支持人胚胎生殖细胞的生长并维持未分化状态。

关键词：包皮成纤维细胞胚胎生殖细胞饲养层酶联免疫吸附测定-双抗夹心法免疫组织化学反转录-聚合酶链式反应人

人胚胎干细胞在人源和鼠源饲养层上的生长特性比较

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中国组织工程研究与临床康复 2009年第49期13卷 9757-9760页

作者：胡智兴周轶平吴兰鸥罗敏郑春兰李玛琳昆明医学院药理学教研室云南省昆明市650031 昆明医学院生物工程中心云南省昆明市650031 昆明医学院云南省天然药物药理重点实验室云南省昆明市650031

背景:不同来源饲养层条件下,人胚胎干细胞是否具有相同或相似的生物学特性尚不清楚,该问题的解决有利于建立标准化的饲养层体系。目的:观察比较人胚胎干细胞在人源和鼠源饲养层上的生长特性是否相同?设计、时间及地点:细胞学体外观察,于... 详细信息

背景:不同来源饲养层条件下,人胚胎干细胞是否具有相同或相似的生物学特性尚不清楚,该问题的解决有利于建立标准化的饲养层体系。目的:观察比较人胚胎干细胞在人源和鼠源饲养层上的生长特性是否相同?设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-09/2009-02在中国科学院昆明动物所完成。材料:清洁级孕12.5～13.5d的ICR小鼠2只,由昆明医学院动物中心提供。永生化人成纤维细胞由美国约翰霍普金斯大学医学院建系并赠送,人胚胎干细胞株BG02由中国科学院昆明动物所提供。方法:无菌条件下取ICR胎鼠,组织块胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,永生化人成纤维细胞按常规培养,两种细胞经γ射线处理后,以2.5×104/cm3接种在明胶包被的6孔板中。取人胚胎干细胞,分别接种在小鼠胚胎成纤维细胞或永生化人成纤维细胞饲养层上,加入含β-巯基乙醇的DMEM/F12培养基,使用前添加碱性成纤维细胞生长因子。主要观察指标:两种饲养层上的人胚胎干细胞的形态、特异性标记表达、Oct-4阳性率、细胞倍增时间。结果:培养在小鼠胚胎成纤维细胞和永生化人成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞,其形态相似,呈圆形或椭圆形集落;均表达SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81和Oct-4,但不表达SSEA-1。与小鼠胚胎成纤维细胞饲养层比较,永生化人成纤维细胞饲养层上人胚胎干细胞Oct-4阳性细胞率明显升高(P饲养层上的人胚胎干细胞体外培养生物学特性存在明显差异。

关键词：人胚胎干细胞培养饲养层成纤维细胞

国产丝裂霉素处理的STO细胞作为饲养层培养牛胚胎干细胞

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农业生物技术学报 2012年第11期20卷 1306-1314页

作者：丛姗王瑞郝斐温建勋毕兆伟诺明途刘东军内蒙古大学哺乳动物生殖生物学教育部重点实验室

寻找一种适合牛胚胎干细胞生长的饲养层对成功培育牛胚胎干细胞有重要意义。本研究采用不同浓度国产丝裂霉素处理的SIM小鼠（Mus musculus）成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐鸟苯苷亚系（STO细胞）作为饲养层培养牛胚胎干细胞,为牛胚胎干细... 详细信息

寻找一种适合牛胚胎干细胞生长的饲养层对成功培育牛胚胎干细胞有重要意义。本研究采用不同浓度国产丝裂霉素处理的SIM小鼠（Mus musculus）成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐鸟苯苷亚系（STO细胞）作为饲养层培养牛胚胎干细胞,为牛胚胎干细胞培养体系的建立提供实验依据。用10、15、20、30和40μg/mL国产丝裂霉素分别处理1.5、3.0和4.0h的STO细胞;形态学观察不同代次STO细胞生长状态,并对生长在以STO细胞为饲养层的牛胚胎干细胞进行碱性磷酸酶染色（AKP）、阶段特异性胚胎细胞表面抗原-4（OCT-4）和阶段特异性胚胎抗原-1（SSEA-1）免疫组化检测、体外分化形成拟胚体等实验。结果显示,当丝裂霉素的浓度为15μg/mL处理3.0h可有效的抑制细胞分裂;STO细胞在5;0代作为饲养层细胞形态最好且获得的牛胚胎干细胞AKP染色及OCT-4和SSEA-1抗原表达均成阳性,分别在体外分化培养形成了拟胚体。结果证明使用国产丝裂霉素能有效地处理STO细胞且在以STO细胞作为饲养层培养的牛胚胎干细胞能保持未分化状态,可以作为常规饲养层培养牛胚胎干细胞。

关键词：国产丝裂霉素饲养层 STO细胞胚胎干细胞