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基于单克隆抗体的双酚A间接竞争酶联免疫分析法的建立

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食品研究与开发 2020年第17期41卷 172-177页

作者：张玉超刘旭东茅台学院酿酒工程系贵州仁怀564507 茅台学院食品科学与工程系贵州仁怀564507

为建立一种简便、快速、准确的双酚A检测方法,采用活性酯法将双酚酸与牛血清蛋白、卵清蛋白偶联制备人工抗原免疫BALB/c小鼠。选择抗血清效价和灵敏度高的BALB/c小鼠,采用聚乙二醇法制备杂交瘤细胞,获得一株可分泌双酚A单克隆抗体的杂... 详细信息

为建立一种简便、快速、准确的双酚A检测方法,采用活性酯法将双酚酸与牛血清蛋白、卵清蛋白偶联制备人工抗原免疫BALB/c小鼠。选择抗血清效价和灵敏度高的BALB/c小鼠,采用聚乙二醇法制备杂交瘤细胞,获得一株可分泌双酚A单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过方阵滴定和反应条件优化,建立一种基于单克隆抗体的双酚A间接竞争酶联免疫分析法。该检测方法在0.5 ng/mL^50 ng/mL内有良好的线性关系,最低检测限IC10为0.5 ng/mL,半数抑制率IC50为16.65 ng/mL,水样中加标回收率为89.72%~105.25%。该单克隆抗体效价高、特异性强,该检测方法灵敏度高。

关键词：双酚A 人工抗原单克隆抗体间接竞争酶联免疫分析法

基于单克隆抗体的间接竞争酶联免疫分析法检测玉米赤霉烯酮

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基于单克隆抗体的间接竞争酶联免疫分析法检测玉米赤霉烯酮

间接竞争酶联免疫分析法测定葛根中葛根素的含量

中国食品科学技术学会第十九届年会

作者：刘文韬邱金平陆旸天津科技大学食品科学与工程学院

目的:针对玉米赤霉烯酮(ZEN)建立一种准确、灵敏的间接竞争酶联免疫法。方法:通过羧甲基羟胺法合成玉米赤霉烯酮半抗原,采用碳二亚胺法分别偶联牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵白蛋白(OVA)合成玉米赤霉烯酮免疫原(ZEN-CMO-BSA)、包被原(ZEN-CMO... 详细信息

目的:针对玉米赤霉烯酮(ZEN)建立一种准确、灵敏的间接竞争酶联免疫法。方法:通过羧甲基羟胺法合成玉米赤霉烯酮半抗原,采用碳二亚胺法分别偶联牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵白蛋白(OVA)合成玉米赤霉烯酮免疫原(ZEN-CMO-BSA)、包被原(ZEN-CMO-OVA)。免疫原(ZEN-CMO-BSA)经MALDI-TOF测定偶联比后用于免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合、筛选,以及细胞克隆化后,得到一株编号为5D10B12G3的杂交瘤细胞株,采用体内诱生法制备腹水,并使用辛酸-硫酸铵沉淀法对小鼠腹水进行纯化。对纯化后的抗体采用间接ELISA法测定抗体亲和力常数,并用此株单抗建立间接竞争酶联免疫法:包被量为0.05μg/孔,抗体稀释64000倍,0.5%脱脂乳粉为封闭液,0.01 mol/L PBS(pH 7.4)为抗体及标品稀释液。结果:免疫原(ZEN-CMO-BSA)经MALDI-TOF测定偶联比为19.5,5D10B12G3株抗体亲和力常数为4.05×10 L/mol,在最优试验条件下,该方法灵敏度(IC)为0.37μg/L,检出限(IC)为0.05μg/L。讨论:该检测方法灵敏度高,操作相对简便,检出限(IC)为0.05μg/L,远低于国家限量标准。

关键词：玉米赤霉烯酮单克隆抗体间接竞争酶联免疫分析法

来源： cnki会议评论

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环球中医药 2015年第9期8卷 1089-1092页

作者：单文超冯会宾赵琰曾文浩贺娜娜赵妍孙晔屈会化北京中医药大学中药学院硕士研究生100102 北京中医药大学基础医学院 100102 北京中医药大学科研实验中心 100102

目的利用间接竞争酶联免疫分析法（indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA）测定葛根中葛根素的含量。方法利用抗葛根素单克隆抗体,通过线性关系、精密度、回收率的考察,建立葛根素的ic-ELISA分析方法。结... 详细信息

目的利用间接竞争酶联免疫分析法（indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA）测定葛根中葛根素的含量。方法利用抗葛根素单克隆抗体,通过线性关系、精密度、回收率的考察,建立葛根素的ic-ELISA分析方法。结果该方法的线性范围为15.6～500ng/m L,孔间差和板间差均不大于3.5%,平均回收率为101.8%,并且该法检测结果与高效液相色谱法检测结果一致。结论本实验为葛根质量控制以及含葛根药材的中药复方中葛根素的含量测定提供了一种新技术方法。

关键词：间接竞争酶联免疫分析法葛根素葛根含量测定

微囊藻毒素纳米抗体的制备及其间接竞争酶联免疫分析方法的建立

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中国食品学报 2022年第5期22卷 332-337页

作者：司睿吴广培王锋雷红涛王弘华南农业大学食品学院广东省食品质量与安全重点实验室畜产品精准加工与安全控制技术国家地方联合工程研究中心(广东) 广州510642

微囊藻毒素(MC)作为肝毒性最强的藻毒素之一,在受污染的水体中时常检出,严重威胁着人畜饮水安全,加强其检测十分重要。在前期研究中,已成功构建抗MC-LR噬菌体展示纳米抗体文库。本研究以MC-LR-OVA作为包被原,经4轮固相淘筛,获得纳米抗体... 详细信息

微囊藻毒素(MC)作为肝毒性最强的藻毒素之一,在受污染的水体中时常检出,严重威胁着人畜饮水安全,加强其检测十分重要。在前期研究中,已成功构建抗MC-LR噬菌体展示纳米抗体文库。本研究以MC-LR-OVA作为包被原,经4轮固相淘筛,获得纳米抗体M110。该抗体可识别MC-LR,且具有良好的稳定性。基于纳米抗体M110建立了检测MC-LR的间接竞争酶联免疫分析法(ic-ELISA),检测的半抑制浓度IC50值为3.55 ng/mL,检测限0.65 ng/mL,线性范围1.28~9.88 ng/mL。与UPLC-MS/MS方法检测结果相关系数达0.998,提示本方法可用于水体中微囊藻毒素残留的检测。

关键词：微囊藻毒素纳米抗体淘筛间接竞争酶联免疫分析法

呋喃西林代谢物半抗原的制备及其免疫检测中的应用

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现代食品科技 2018年第3期34卷 90-94,100页

作者：李斌俞思明胡睿于淑娟华南理工大学食品科学与工程学院广东广州510640 广州润坤生物科技有限公司广东广州510800 暨南大学生物材料广东高校重点实验室生物医学工程系广东广州510632

本研究为了克服现有SEM半抗原结构不含硝基端基团的不足,将SEM与4-(3-醛基-4-硝基-苯氧基)-丁酸衍生制备半抗原,保留了硝基端基团。然后,将制备的半抗原分别与BSA和OVA偶联制备SEM-BSA免疫原和SEM-OVA包被原。免疫原免疫BALB/C小鼠后,... 详细信息

本研究为了克服现有SEM半抗原结构不含硝基端基团的不足,将SEM与4-(3-醛基-4-硝基-苯氧基)-丁酸衍生制备半抗原,保留了硝基端基团。然后,将制备的半抗原分别与BSA和OVA偶联制备SEM-BSA免疫原和SEM-OVA包被原。免疫原免疫BALB/C小鼠后,结合细胞融合技术制备单克隆抗体,并利用间接竞争酶联免疫分析法(ci ELISA)评价单克隆抗体的效价及特异性。结果显示,单克隆抗体可特异性识别SEM的2-硝基苯甲醛衍生物(2-NPSEM),效价达1:2560000。应用ci ELISA检测法,在0.05~4.05μg/L呈线性关系,检测限高达0.04μg/L,IC_(50)值为0.23μg/L,与结构类似物NPAMOZ、NPAOZ和NPAHD的交叉反应率分别为0.03%、0.02%和0.26%。本论文提供的SEM半抗原的设计和改造方法,为呋喃西林的代谢物SEM的高效检测提供了新思路和方法。

关键词：呋喃西林代谢物氨基脲单克隆抗体间接竞争酶联免疫分析法

燕窝唾液酸糖蛋白间接竞争酶联免疫检测方法的建立

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食品安全质量检测学报 2022年第23期13卷 7630-7636页

作者：何金麟王仍瑞张世伟冯荣虎范群艳柳训才徐敦明厦门海关技术中心厦门361026 深圳市计量质量检测研究院深圳518102 厦门市燕之屋丝浓食品有限公司厦门361100

目的建立间接竞争酶联免疫(indirect competitive enzyme linked immunesorbent assay,IC-ELISA)检测燕窝中唾液酸糖蛋白的分析方法。方法以唾液酸糖蛋白为抗原,制备单克隆抗体,对IC-ELISA步骤中相关参数进行优化,确定最佳反应条件。结... 详细信息

目的建立间接竞争酶联免疫(indirect competitive enzyme linked immunesorbent assay,IC-ELISA)检测燕窝中唾液酸糖蛋白的分析方法。方法以唾液酸糖蛋白为抗原,制备单克隆抗体,对IC-ELISA步骤中相关参数进行优化,确定最佳反应条件。结果最佳包被抗原为1:2000,抗体稀释倍数为1:5000;封闭液浓度为1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),封闭时间为150 min;竞争时间30 min;酶标二抗浓度稀释倍数为1:1000,孵育时间30 min;显色时间为10 min。建立的IC-ELISA检测方法半抑制浓度(50%inhibition concentration,IC_(50))为8.61μg/mL,线性范围为2.23~33.25μg/mL,回收率为82.7%~92.0%,相对标准偏差(relative standard deviation,RSDs)为1.7%~8.9%。结论该方法灵敏度较高、特异性强,可以有效地鉴别假冒伪劣燕窝产品,具有较好的实际应用价值。

关键词：燕窝唾液酸糖蛋白间接竞争酶联免疫分析法

草甘膦单克隆抗体的制备及酶联免疫分析方法的建立

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食品安全质量检测学报 2023年第16期14卷 205-212页

作者：杜斌岳绪辉罗建芝袁学伟姚南南陈海军杨梅令狐克勇贵阳学院食品与制药工程学院贵阳550000 贵州绿通检测技术有限公司贵阳550000 贵阳农产品物流发展有限公司贵阳550000 贵州国芯生物科技有限公司贵阳550000

目的制备出草甘膦(glyphosate,GLY)单克隆抗体,建立间接竞争酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)快速检测茶叶中GLY的方法。方法首先合成GLY完全抗原(包被原和免疫原),通过免疫小鼠成功制备出GLY单克隆抗体。根据E... 详细信息

目的制备出草甘膦(glyphosate,GLY)单克隆抗体,建立间接竞争酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)快速检测茶叶中GLY的方法。方法首先合成GLY完全抗原(包被原和免疫原),通过免疫小鼠成功制备出GLY单克隆抗体。根据ELISA的检测流程,采用棋盘法确定最佳包被抗原和抗体的稀释倍数,确定最佳包被的温度和时间,并确定最佳加入一抗、二抗后反应时间,建立检测方法并对其性能进行评价。结果GLY包被抗原和抗体的稀释倍数为1:2000,包被温度为37℃、包被时间为90 min,加入一抗、二抗后反应时间为60 min。该方法的线性方程为Y=-0.2353X+0.6539(r2=0.9871),半抑制浓度(50%inhibiting concentration,IC50)为4.508 ng/mL,检出限为1.18 ng/mL。变异系数均在10%以下,与异菌脲、多菌灵、三唑磷、甲基对硫磷、噻菌灵这5种标准品的交叉反应率均低于0.03%,在茶叶中加标回收率为90.86%~110.35%,且相对标准偏差均小于10%。结论该方法具有较高的灵敏度和特异性,可用于茶叶样本中GLY残留的快速检测。

关键词：草甘膦完全抗原单克隆抗体间接竞争酶联免疫分析法

唑螨酯单克隆抗体的研发及免疫分析方法的建立

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唑螨酯单克隆抗体的研发及免疫分析方法的建立

作者：彭怡霖西南大学

学位级别：硕士

唑螨酯是一种苯氧基吡唑类杀螨剂,主要应用于防治苹果、柑橘、桃、梨等果树及农作物上的植食性螨虫。在农业生产中施用的唑螨酯,可直接或间接地进入土壤甚至地下水造成环境污染。唑螨酯对多数哺乳动物毒性较弱,但对水生生物具有较大毒性... 详细信息

唑螨酯是一种苯氧基吡唑类杀螨剂,主要应用于防治苹果、柑橘、桃、梨等果树及农作物上的植食性螨虫。在农业生产中施用的唑螨酯,可直接或间接地进入土壤甚至地下水造成环境污染。唑螨酯对多数哺乳动物毒性较弱,但对水生生物具有较大毒性,作为线粒体活性的一种有效抑制剂,具有神经毒性,能造成人类神经元的ATP耗竭、氧化损伤甚至细胞死亡,还可能与帕金森病密切相关。因此,开发快速、灵敏、简单的唑螨酯残留检测方法非常有必要。目前,液相色谱和液相色谱质谱联用等技术已广泛应用于环境和食品样品中唑螨酯的检测,但仪器方法存在设备昂贵,操作要求专业性强,前处理过程复杂等问题。而免疫分析方法简单快速、灵敏度高、检测成本低、可用于大规模筛选样品,是一种非常有潜力的检测方法。因此,研究唑螨酯的免疫分析技术具有重要的意义。本研究以唑螨酯为对象,设计合成了唑螨酯半抗原和完全抗原,制备出抗唑螨酯单克隆抗体,并建立了相应的间接竞争酶联免疫分析法(ic ELISA)和化学发光酶联免疫分析法(CLEIA)。(1)设计合成了4种具有活性基团(-COOH)的唑螨酯半抗原,均通过核磁共振波谱仪和质谱进行表征,证实所合成的4种半抗原结构正确。通过活性酯法将半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联制得包被原、与牛血清蛋白(BSA)偶联制得免疫原。免疫原(唑螨酯半抗原A-BSA)免疫小鼠后测定血清效价,证实所制备的人工抗原具备免疫原性,能够有效刺激小鼠产生针对唑螨酯的抗体。将棋盘格法筛选出的血清效价高、特异性强的小鼠加强免,用于后续单克隆抗体的制备。(2)通过杂交瘤细胞技术筛选出能够特异性识别唑螨酯的单克隆细胞株2G4C7,通过小鼠体内诱生法将该细胞株进行扩大繁殖,采集腹水后建立相应的ic ELISA。该抗体特异性高,与常见的杀螨剂均无交叉反应。基于抗体mAb 2G4C7建立了异源包被ic ELISA法,最佳工作范围(IC～IC)为4.77～187.28 ng/m L,半数抑制率(IC)为30.92 ng/m L。在柑橘和苹果中的回收率分别为88.9%～119.1%、73.3%～115.4%,相对标准偏差(RSD)分别为1.1%～7.7%、3.8%～6.8%,说明方法重复性良好。通过ic ELISA和超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时对柑橘实际样品进行检测,显示两种方法的检测结果吻合程度高。以上表明基于mAb 2G4C7所建立的ic ELISA法准确、高效,能够应用于柑橘和苹果中唑螨酯的残留检测,满足实际市场高通量的快速检测要求。(3)基于抗体mAb 2G4C7建立了唑螨酯间接竞争CLEIA。在CLEIA法的建立中,考察了包被原和抗体浓度、化学发光板、酶标二抗的稀释倍数、缓冲溶液中有机溶剂以及缓冲溶液p H值对CLEIA方法的影响。在各优化条件下,基于抗体mAb 2G4C7建立了CLEIA法,绘制出标准曲线,方法IC值为3.9 ng/m L,相较于检测唑螨酯的ic ELISA法灵敏度提高了7倍多,最佳工作范围(IC～IC)为0.4～29.8 ng/m L。该方法重复性良好,在柑橘和苹果中的回收率分别为78.4%～94.7%、80.8%～103.9%,RSD分别为0.2%～5.1%、0.4%～4.6%;通过CLEIA和UPLC-MS/MS同时对柑橘实际样品进行检测,显示两种方法的检测结果吻合程度高。以上表明成功建立了检测柑橘和苹果中唑螨酯残留的CLEIA法,方法灵敏度高,对于实现食品中唑螨酯的快速筛检具有重要参考价值。(4)基于抗体mAb 2G4C7对唑螨酯水解产物(Hapten A)有较高的灵敏度,且唑螨酯在二氯甲烷和三氟乙酸3:1的条件下能够完全水解成Hapten A,建立了通过测定唑螨酯水解产物Hapten A实现间接检测唑螨酯的ic ELISA法,显著提高了唑螨酯ic ELISA法的灵敏度。所建立的ic ELISA方法最佳工作范围(IC～IC)为0.07～1.49 ng/m L,IC值为0.34 ng/m L,相较于检测唑螨酯本身的ic ELISA法灵敏度提高了90多倍。该方法重复性良好,在柑橘和苹果中的折算回收率分别为77.0%～105.4%、72.3%～106.4%,RSD分别为1.4%～5.0%、0.5%～4.7%;通过ic ELISA和UPLC-MS/MS同时对柑橘实际样品进行检测,绘制相关性曲线并计算出相关性R=0.98,显示出这两种方法的检测结果吻合程度高。以上表明基于唑螨酯水解产物Hapten A建立的间接检测唑螨酯的ic ELISA法准确、高效且灵敏度高,能够应用于柑橘和苹果中唑螨酯的残留检测,也为提高免疫分析法的灵敏度提供一种新思路。

关键词：半抗原间接竞争酶联免疫分析法化学发光酶联免疫分析法单克隆抗体唑螨酯