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化工进展 2009年第1期28卷 135-140页

作者：李东华王鸿孙汉栋易喻应国清浙江工业大学药学院浙江杭州310032 杭州九源基因工程有限公司浙江杭州310018

以超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)为模板蛋白,将其分离纯化过程和修饰过程耦合起来,从而获得比活更高、稳定性更好的修饰SOD。将SOD选择性地吸附在DEAE-52层析柱和铜离子螯合葡聚糖凝胶柱上,先不经洗脱分离,直接用活化的聚... 详细信息

以超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)为模板蛋白,将其分离纯化过程和修饰过程耦合起来,从而获得比活更高、稳定性更好的修饰SOD。将SOD选择性地吸附在DEAE-52层析柱和铜离子螯合葡聚糖凝胶柱上,先不经洗脱分离,直接用活化的聚乙二醇(PEG)5000对吸附在柱上的SOD进行化学修饰,再通过特异性洗脱分离获得PEG-SOD,使SOD分离纯化和修饰过程同步完成。SOD通过离子交换吸附层析-PEG修饰耦合过程和金属螯合层析-PEG修饰耦合过程,所得的PEG-SOD比活力分别为9638.0U/mg和9067.8U/mg,纯化倍数分别为1.87倍和1.755倍,氨基修饰率分别为35.3%和40.9%。结果表明SOD的分离纯化-化学修饰耦合过程是可行的,且金属螯合层析-修饰耦合过程的效果要优于离子交换吸附层析-修饰耦合过程。

关键词：超氧化物歧化酶化学修饰离子交换层析金属鳌合层析耦合过程

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超氧化物歧化酶分离-修饰耦合过程的研究

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浙江工业大学学报 2009年第1期37卷 9-13页

作者：陈佳乐高飞易喻应国清浙江工业大学药学院浙江杭州310032 艾博生物医药杭州有限公司浙江杭州310018

以超氧化物歧化酶(SOD)为模板蛋白,研究其分离—修饰耦合工艺.即将SOD选择性地吸附在铜离子螯合葡聚糖凝胶层析柱上,先不经洗脱分离,直接用活化的聚乙二醇(PEG)5000对吸附的SOD进行化学修饰,再通过特异性洗脱分离获得PEG-SOD,使得SOD分... 详细信息

以超氧化物歧化酶(SOD)为模板蛋白,研究其分离—修饰耦合工艺.即将SOD选择性地吸附在铜离子螯合葡聚糖凝胶层析柱上,先不经洗脱分离,直接用活化的聚乙二醇(PEG)5000对吸附的SOD进行化学修饰,再通过特异性洗脱分离获得PEG-SOD,使得SOD分离纯化和修饰过程同步完成.获得了一条SOD金属螯合层析分离—PEG化学修饰耦合工艺路线.获得的PEG-SOD比活9 055.1 U/mg,纯化倍数1.75倍,氨基修饰率42.3%,修饰前后活性保留87.1%.证明SOD的分离-修饰耦合工艺是可行的.

关键词：超氧化物歧化酶化学修饰金属鳌合层析耦合过程

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ω-芋螺毒素M ⅦA的表达与纯化

ω-芋螺毒素M ⅦA的表达与纯化

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作者：陈小颖浙江大学

学位级别：硕士

[目的] 芋螺毒素(Conotoxin，CTX)是海洋软体动物芋螺分泌的一类具特异生物活性的小肽神经毒素。一般含10～30个氨基酸，大多富含二硫键，按作用靶位及药理学活性，可分为α，ω，μ等家族。ω-CTX M ⅦA是电压敏感性钙通道(Voltage sen... 详细信息

[目的] 芋螺毒素(Conotoxin，CTX)是海洋软体动物芋螺分泌的一类具特异生物活性的小肽神经毒素。一般含10～30个氨基酸，大多富含二硫键，按作用靶位及药理学活性，可分为α，ω，μ等家族。ω-CTX M ⅦA是电压敏感性钙通道(Voltage sensitive calcium channel，VSCC)阻断剂，主要作用于神经组织的N型VSCC。它由25个氨基酸组成，含6个Cys残基，组成三对二硫键。非临床研究证明它具双重效应，一方面阻断痛觉传递而具镇痛效应，另一方面抑制刺激毒性(Excitotoxic)神经递质释放，阻止神经元细胞病理性钙内流而有神经保护作用。因其直接作用于钙通道，无需第二信使或G蛋白介导，故不成瘾，可用于治疗晚期肿瘤、AIDS病、难治性神经疾病等引起的慢性重症疼痛。国外公司开发的M ⅦA无瘾镇痛药，已进入Ⅲ期临床试验。本研究旨在利用基因工程方法，构建ω-CTX M ⅦA基因原核表达质粒，诱导表达芋螺毒素(CTX)和硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)的融合蛋白，经纯化制备高纯度融合蛋白，为进一步获得目的小肽并研究其生物学活性打下基础。[方法] 根据ω-CTX M ⅦA氨基酸序列，按大肠杆菌偏爱密码子推断设计其DNA片段，5’端添加Kpn Ⅰ酶切位点和肠激酶识别序列，3’端添加TAA终止密码子及EcoR Ⅰ酶切位点，分四个片段分别人工合成。合成的基因片段经退火、连接成完浙江大学硕七学位论文陈小颖整片段，插入经相应内切酶酶切后的原核表达载体pET-32a(+)。连接产物转化感受态大肠杆菌DHS。，挑取转化菌落，分别抽提质粒，经DNA酶切、转化大肠杆菌BLZI(DE3)小量诱导表达、质粒测序三步鉴定重组质粒的DNA序列。将鉴定正确的重组表达质粒pET32a(+)一cTx转化感受态大肠杆菌BLZI (DE3)，经IPTG诱导表达Tr优Tx融合蛋白。超声破菌后取上清液及沉淀分别经SDS一队GE电泳检查，表明融合蛋白几乎都是可溶性的，存在于上清中，故取上清纯化。利用融合蛋白中的6xHis一Tag，采用金属鳌合亲和层析方法(Cu一IDA树脂)纯化融合蛋白，经凝胶过滤除盐，将各次处理的产物分别取样用SDS一PAGE验证含量及纯度，最后合并纯度较高的样品用RP一HPLc(Reverse一phasehigh一performanee liquid ehromatography)鉴定。由于融合蛋白中含多个Cys残基，而目的蛋白CTX的生物学活性决定于它所含的三对二硫键的正确配对，故先在纯化产物中加入一定浓度的琉基乙醇(p一mercaPtoethanol，已一ME)，还原所有可能形成的二硫键，然后在一定的盐浓度下透析去除蛋白液中的卜ME，缓慢空气氧化使之配对形成天然结构的二硫键。经还原氧化处理后的融合蛋白，采用经典的小鼠热板镇痛实验鉴定其生物学活性。l结果l 目的基因与载体基因连接产物转化DH5a后，挑取菌落分别抽提质粒筛选鉴定。DNA酶切重组质粒证实有小片段基因插入，转化BLZI(DE3)菌，经小量诱导表达出符合预计分子量的融合蛋白，DNA测序证实。一CTX M VllA基因序列按预计方案正确插入原核表达载体pE下犯a(+)。经测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BLZI(DE3)，IPTG诱导大量表达，1汾x/C TX融合蛋白，SDS一队GE可见其分子量(MW)约1 9.7 KD符合预计值，表达量约占细菌总蛋白的25%。超声破菌后取上清用 Cu一IDA亲和层析柱纯化，凝胶过滤除盐后将各次取样SDS一PAGE，可见纯度不一的目标融合蛋白。合并纯度较高的样品经RP一HPLC鉴定，Trx/CTX融合蛋白纯度可达95%以上。浙江大学硕士学位论文陈小颖 Trx/C TX融合蛋白经p一ME还原，空气缓慢氧化后形成天然结构的二硫键，

关键词： ω-CTXM ⅦA 基因重组融合蛋白金属鳌合层析镇痛活性钙离子通道阻断剂

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诱生型一氧化氮合酶FAD结合区的克隆、表达和活性鉴定

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药物生物技术 2001年第4期8卷 181-184页

作者：李爱萍徐洪朱敏生朱东亚吴如金智刚 Kim S Lau. James.T.Stull 南京军区军事医学研究所南京210002 中国药科大学南京210009 Southwestern medicalcente rat Dallas.UT.USA Southwestern medicalcenter at Dallas.UT.USA

诱生型的一氧化氮合酶 (iNOS)的表达可以被多种细胞因子、IPS、多种试剂及创伤等诱导 ,很多疾病的产生发展都与iNOS的过度表达有关。为进一步研究iNOSFAD结合区的功能和特异性抑制肽的筛选 ,用PCR方法克隆出iNOSFAD结合区编码基因片段 (... 详细信息

诱生型的一氧化氮合酶 (iNOS)的表达可以被多种细胞因子、IPS、多种试剂及创伤等诱导 ,很多疾病的产生发展都与iNOS的过度表达有关。为进一步研究iNOSFAD结合区的功能和特异性抑制肽的筛选 ,用PCR方法克隆出iNOSFAD结合区编码基因片段 (iNOS2 0 31 2 6 6 0bp) ,并在大肠杆菌中得到高效表达 ,得到表达率 >30 %的包涵体 ;经过Ni金属螯合亲和柱层析和电泳纯化 ,得到纯度 >95 %的重组蛋白 ,相对分子质量为2 3 0 0 0。运用波长扫描 ,证实纯化蛋白具有与FAD的结合活性。

关键词：一氧化氮合酶 FAD结合区重组表达金属鳌合层析诱生型克隆活性鉴定

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