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基于酵母双杂交文库鉴定鸡PGCs形成过程中的关键泛素化修饰酶

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中国家禽 2024年第3期46卷 15-22页

作者：姚泽令常梓翊龚威宋彤彤王志秀张亚妮李碧春左其生扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009 中国教育部国际农业与农产品安全研究联合实验室江苏扬州225009

试验拟筛选与C2EIP互作的蛋白,构建调节PGCs形成过程的泛素化E3连接酶复合体。通过逆转录和同源重组等方法构建鸡PGCs酵母文库;将C2EIP连入诱饵空载体pGBKT7中,并转化酵母感受态细胞进行诱饵载体(C2EIP-pGBKT7)的毒性和自激活检测;将酵... 详细信息

试验拟筛选与C2EIP互作的蛋白,构建调节PGCs形成过程的泛素化E3连接酶复合体。通过逆转录和同源重组等方法构建鸡PGCs酵母文库;将C2EIP连入诱饵空载体pGBKT7中,并转化酵母感受态细胞进行诱饵载体(C2EIP-pGBKT7)的毒性和自激活检测;将酵母文库与诱饵载体菌液共培养后,通过涂板筛选阳性克隆并进行测序和生物信息学分析筛选互作蛋白。结果显示:成功构建了鸡PGCs酵母文库,其滴度为3.0×10^(6)cfu/mL,总库容为1.5×10^(7)cfu,且重组率为100%,符合筛库要求。成功构建无毒性和不能自激活的C2EIP-pGBKT7诱饵载体,能够用于后续的文库筛选。C2EIP-pGBKT7诱饵载体菌液与酵母文库共培养后,通过PCR测序与蛋白序列分析后共筛选了36个C2EIP的互作蛋白,其中RCJMBM04和CCDC174蛋白功能域分析发现分别具有典型的RING功能域和PPXY基序,进行的生物信息学分析发现WWP1和WWP2具有典型的WW功能域,能够与CCDC174结合。研究表明,试验成功鉴定了C2EIP/RCJMB04/CCDC174/WWP泛素化E3连接酶复合体,为后续研究泛素化修饰调控鸡PGCs形成机制奠定理论基础。

关键词：鸡原始生殖细胞泛素化修饰 C2EIP 酵母双杂交文库

大豆酵母双杂交混合文库构建及GmCTP互作蛋白筛选

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烟台大学学报(自然科学与工程版) 2024年

作者：单童陈磊徐文静林越朱雁赵婧烟台大学生命科学学院

通过Gateway技术构建优异大豆品种冀豆17根、茎、叶、花4种器官组织的酵母双杂交混合文库，筛选与大豆叶形及花发育调控新基因GmCTP编码蛋白的互作因子，为后续对GmCTP基因的调控机制分析提供重要线索。结果表明：酵母次级文库重组率为... 详细信息

通过Gateway技术构建优异大豆品种冀豆17根、茎、叶、花4种器官组织的酵母双杂交混合文库，筛选与大豆叶形及花发育调控新基因GmCTP编码蛋白的互作因子，为后续对GmCTP基因的调控机制分析提供重要线索。结果表明：酵母次级文库重组率为100％，库容CFU＝1.44×107，文库滴度为3.6×107个/mL，插入片段的平均长度大于1000 bp。自激活检测显示诱饵载体pGBKT7-CTP无自激活活性。通过酵母mating方法进行文库筛选，在四缺培养基上检测到110个阳性菌落，通过四缺+X-α-Gal复选，得到45个强阳性蓝色菌落。阳性菌落PCR测序结果发现阳性菌落中的LBD家族基因的功能与GmCTP基因突变导致的表型密切相关，为后续对GmCTP基因调控叶形发育的分子机制提供了重要线索。

关键词：大豆酵母双杂交文库 CTP 叶发育

香蕉果实酵母双杂交文库的构建及后熟转录因子MaMADS2互作蛋白筛选

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南京农业大学学报 2023年第2期46卷 237-246页

作者：王川盛鸥窦同心李斌胡春华杨乔松邓贵明董涛李春雨易干军毕方铖广东省农业科学院果树研究所/农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室/广东省热带亚热带果树研究重点实验室广东广州510640 华中农业大学园艺林学院湖北武汉430070

[目的]本文旨在鉴定香蕉果实后熟关键调控因子MaMADS2的互作蛋白,深入解析MaMADS2影响香蕉果实后熟过程的分子机制。[方法]以MaMADS2为诱饵利用酵母双杂交文库获得候选互作蛋白,通过克隆候选互作基因编码区进行点对点酵母双杂交试验来... 详细信息

[目的]本文旨在鉴定香蕉果实后熟关键调控因子MaMADS2的互作蛋白,深入解析MaMADS2影响香蕉果实后熟过程的分子机制。[方法]以MaMADS2为诱饵利用酵母双杂交文库获得候选互作蛋白,通过克隆候选互作基因编码区进行点对点酵母双杂交试验来验证互作情况;利用转录组学分析互作蛋白相关基因在后熟过程中的表达情况;利用双分子荧光互补试验鉴定重要互作蛋白与MaMADS2的互作;最后用蛋白免疫印迹分析MaMADS2蛋白在香蕉后熟过程中的表达。[结果]成功构建了果实在乙烯利催熟下的cDNA文库,初级和次级文库的库容分别为2.9×10^(6)和3.2×10^(6)CFU·mL^(-1),平均插入片段大小在1200 bp以上,可满足后续酵母双杂交筛选的要求。最终共鉴定出7个互作蛋白,其中有2个MADS-box转录因子,3个E3泛素连接酶,2个具有转录抑制作用的蛋白。转录组数据表明,乙烯利可抑制2个MADS-box基因的表达,而1-甲基环丙烯(1-MCP)对其表达起诱导作用。双分子荧光互补试验表明,MaMADS2与MADS-box转录因子Ma04_p30020.1存在互作关系。蛋白免疫印迹分析显示,MaMADS2在后熟过程中蛋白水平逐渐降低,这与其可以和E3泛素连接酶互作是一致的。[结论]通过构建高质量的果实cDNA文库与酵母双杂交筛库技术,鉴定出多个与MaMADS2互作的蛋白,并明确了MaMADS2与另一MADS-box转录因子Ma04_p30020.1之间存在明显的互作关系。

关键词：香蕉酵母双杂交文库 MaMADS2 互作蛋白果实成熟

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斜纹夜蛾酵母双杂交文库的构建及其在蜕皮激素受体互作蛋白筛选中的应用

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昆虫学报 2016年第8期59卷 801-811页

作者：范琳芳何文婧苏智仁朱家明罗威张纯黄立华华南师范大学生命科学学院广州市昆虫发育调控与应用研究重点实验室广州510631 广东省农业科学研究院植物保护研究所广东省植物保护新技术重点实验室广州510640

【目的】蜕皮激素在昆虫变态发育中起着关键的调控作用。蜕皮激素活化为20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone,20E）后与蜕皮激素受体二聚体〔蜕皮激素受体（ecdysone receptor,EcR）和超气门蛋白（ultraspiracle protein,USP）〕结合,启... 详细信息

【目的】蜕皮激素在昆虫变态发育中起着关键的调控作用。蜕皮激素活化为20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone,20E）后与蜕皮激素受体二聚体〔蜕皮激素受体（ecdysone receptor,EcR）和超气门蛋白（ultraspiracle protein,USP）〕结合,启动20E诱导的级联反应。本研究旨在从互作蛋白角度探究EcR/USP自身调控的分子机理。【方法】以重要农业害虫斜纹夜蛾Spodoptera litura为研究对象,通过构建酵母双杂交筛选系统分别筛选了与EcR和USP相互作用的蛋白。【结果】文库转化效率达到3.0×106cfu/μg,文库滴度达到1.3×108cfu/m L,文库插入片段大小在500~2 000 bp之间。4种诱饵质粒（EcRA/p GBKT7,EcRB1/p GBKT7,USP1/p GBKT7和USP2/p GBKT7）对酵母细胞无毒性,并且无自激活性,说明构建的酵母双杂交文库质量可靠。用以上4种诱饵质粒筛选酵母双杂交文库,共得到110个互作蛋白,其中与EcRB1,USP1和USP2互作的蛋白分别有26,52和32个,未筛选到与EcRA互作的蛋白。随后,从中挑选了Dna J-5（Hsp40 homolog 5,一种热激蛋白分子伴侣）,MBF2（mediator of Bm FTZ-F1 type 2,一种转录共激活子）,polyubiquitin（多聚泛素类蛋白）,esr16（ecdysteroid regulated 16k Da protein,一种蜕皮激素调控蛋白）和NEDD8-like（neural precursor cell expressed,developmentally down-regulated protein 8,一种泛素调节相关蛋白）5种蛋白,利用酵母双杂交和Far-Western印迹法进一步验证了蛋白间的互作关系。【结论】分子伴侣和泛素化修饰等在蜕皮激素受体调控中可能起着重要作用。本研究对深入理解昆虫变态发育的分子机理具有重要意义。

关键词：斜纹夜蛾变态发育蜕皮激素受体酵母双杂交文库互作蛋白

西花蓟马酵母双杂交文库及TSWV膜蛋白诱饵载体的构建

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应用昆虫学报 2019年第1期56卷 99-106页

作者：万岩然郑晓斌袁江江张友军吴青君河北农业大学植物保护学院保定071000 中国农业科学院蔬菜花卉研究所北京100081

【目的】为筛选西花蓟马Frankliniella occidentalis与番茄斑萎病毒的互作蛋白。【方法】利用MakeYour Own"Mate&Plate?"Library System构建西花蓟马酵母双杂交初级cDNA文库以及Y187酵母次级文库,利用Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System构建TSWV膜蛋白GN及GC诱饵载体。【结果】建立的西花蓟马初级cDNA文库库容为5.6×106 cfu,其插入片段平均长度大于1 000 bp,重组率约为100%。建立的Y187酵母次级文库转化效率为5×106cfu/μg,文库滴度为2.97×108。构建的pGNKT7-GN及pGBKT7-GC诱饵载体能够在Y2HGold酵母菌株中正确表达,无自激活活性且无毒性。【结论】成功构建了西花蓟马酵母双杂交文库以及番茄斑萎病毒膜蛋白诱饵载体,可用于后续筛库实验。

关键词：西花蓟马番茄斑萎病毒酵母双杂交文库诱饵载体

可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)酵母双杂交文库和铁结合蛋白真核表达载体的构建

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海洋与湖沼 2013年第6期44卷 1506-1511页

作者：张云云周君李晔张春丹蔡江佳陈丽萍李太武苏秀榕宁波大学海洋学院宁波315211 宁波城市职业技术学院宁波315100

构建了可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)的酵母双杂文库,总克隆数为6.09×106CFU,重组率100%,平均插入片段长度>1kb。随机挑取200个克隆子测序,结果 1个空载,67个无法对应的基因类型,已知的132个基因中线粒体蛋白占29.54%,蚯蚓血... 详细信息

构建了可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)的酵母双杂文库,总克隆数为6.09×106CFU,重组率100%,平均插入片段长度>1kb。随机挑取200个克隆子测序,结果 1个空载,67个无法对应的基因类型,已知的132个基因中线粒体蛋白占29.54%,蚯蚓血红蛋白15.9%,核糖体蛋白10.6%,铁结合蛋白8.3%,肌动蛋白6.1%,其它基因29.56%。这些基因分别为:5-氨基乙酰丙酸合成酶、类博莱霉素水解酶、纤溶蛋白、谷氨酰胺合成酶、热休克蛋白、非特性类碱性磷酸酶、脂肪酶、金属蛋白、线粒体、硫氧还蛋白、蛋白磷酸酶、肌钙蛋白C、泛素。根据已获得的可口革囊星虫铁结合蛋白基因,以EcoRⅠ和KpnⅠ为双酶切位点设计引物,构建了可口革囊星虫铁结合蛋白真核表达载体pPink-HC-fer,经PCR及测序检验,序列完全正确,然后电转化至酵母细胞中诱导表达,经SDS-PAGE检验其融合蛋白分子量大小约为23kDa。

关键词：可口革囊星虫铁结合蛋白酵母双杂交文库真核表达

柑橘酵母双杂交文库构建及黄龙病菌SDE34的寄主靶标筛选

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农业生物技术学报 2023年第12期31卷 2589-2598页

作者：胡衍铵曾丽华李竹李凤瑶黄玉林李瑞民黄桂艳赣南师范大学生命科学学院国家脐橙工程技术研究中心

黄龙病是柑橘产业中最具毁灭性的病害，主要由韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)引发，其致病机理尚不清楚。Sec依赖型效应蛋白(sec-dependent effectors, SDE34)(CLIBASIA＿04055)是黄龙病菌的核心SDE效应蛋白之一，为了筛选黄龙病菌SDE34在柑橘中的寄主靶标，本研究以感染黄龙病的纽荷尔脐橙(Citrus sinensis)叶片为材料构建酵母双杂交(yeast two hybrid, Y2H) cDNA文库，通过Y2H技术筛选与SDE34互作的柑橘蛋白，并利用双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)对其互作进行验证。结果表明，本研究构建的酵母双杂交cDNA文库滴度为2.3×108CFU/mL，插入片段长度为300～2 000 bp。通过Y2H筛选到3个柑橘蛋白与SDE34互作，其中重金属相关的异戊二烯化植物蛋白(heavy metal-associated isoprenylated plant protein, HIPP7)的筛选频率高达83.33%,BiFC结果表明，HIPP7与SDE34在植物细胞中互作。亚细胞定位结果表明，HIPP7在植物细胞质和细胞核中均有分布。实时荧光定量PCR分析发现，感染黄龙病后，HIPP7基因极其显著下调表达(P<0.001)。HIPP7同源基因在多种植物-病原菌互作体系中作为感病基因发挥功能，提示SDE34可能通过靶向柑橘感病基因HIPP7促进黄龙病菌侵染。本研究为解析黄龙病的致病机理以及柑橘抗病育种提供理论依据。

关键词：黄龙病 Sec依赖型效应蛋白(SDE) 酵母双杂交文库蛋白互作感病基因

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小麦酵母双杂交文库构建及文库质量的鉴定

西北农业学报 2022年第8期31卷 948-957页

作者：李立群王冰心吕千杨智全西北农林科技大学农学院陕西杨凌712100

以中国春小麦叶、茎、幼穗及花后3、6、9、12、15、20、25d的籽粒为材料,利用Gateway技术构建中国春小麦cDNA初级文库和次级文库,由次级文库质粒转化Y187酵母菌株构建出酵母双杂交文库。通过mating法筛选小麦粒质量基因TaDAR1的互作蛋白... 详细信息

以中国春小麦叶、茎、幼穗及花后3、6、9、12、15、20、25d的籽粒为材料,利用Gateway技术构建中国春小麦cDNA初级文库和次级文库,由次级文库质粒转化Y187酵母菌株构建出酵母双杂交文库。通过mating法筛选小麦粒质量基因TaDAR1的互作蛋白,以此来鉴定文库的有效性。结果表明:初级文库容量为1.82×10^(7) CFU/mL、次级文库的容量为1.91×10^(7) CFU/mL,文库重组率均大于96%,插入片段平均长度在1000bp以上。酵母双杂交文库转化效率为1.97×10^(5)CFU/μg,文库容量为2.04×10^(7)CFU/mL。构建诱饵载体pGBKT7-TaDAR1并转化Y2H酵母菌株,经检验存在自激活现象,进一步截断检测发现此蛋白N端无自激活,C端有自激活,以BD-TaDAR1-N为诱饵载体,筛选酵母文库,获得其互作蛋白序列,并命名为Ta-DAR1IP,经回转验证TaDAR1-N与TaDAR1IP存在相互作用关系。表明本试验方案构建的酵母文库是高质量的有效的。为初学者构建酵母双杂文库及使用“mating”法筛选酵母文库提供借鉴,也为后续小麦基因功能的研究奠定基础。

关键词：小麦酵母双杂交文库自激活检测文库筛选

从人肾癌酵母双杂交文库中筛选TCF4相关蛋白

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中华泌尿外科杂志 2003年第12期24卷 797-799页

作者：叶雄俊林桂亭张志文陈培拉辛殿祺常智杰郭应禄 100034 北京大学第一医院泌尿外科北京大学泌尿外科研究所北京大学医学部生理学系清华大学生物系基因组研究所

目的　应用酵母双杂交技术寻找在肾癌发生过程中与Wnt信号家族成员T细胞因子 4(TCF4)相互作用的新蛋白。　方法　以Wnt通路中的关键信号分子TCF4的N端和DNA结合域(TCF4ND ,1～ 495aa)为诱饵蛋白 ,筛选肾癌双杂交文库 ,得到的阳性克隆酶... 详细信息

目的　应用酵母双杂交技术寻找在肾癌发生过程中与Wnt信号家族成员T细胞因子 4(TCF4)相互作用的新蛋白。　方法　以Wnt通路中的关键信号分子TCF4的N端和DNA结合域(TCF4ND ,1～ 495aa)为诱饵蛋白 ,筛选肾癌双杂交文库 ,得到的阳性克隆酶切分类 ,测序后在GenBank中进行Blast分析。　结果　筛出与hTCF4相互作用的阳性克隆 51个 ,包括 β环连蛋白 (β catenin) ,hTCF4,激活转录因子 5(ATF5) ,人类锌指蛋白等 ,其中未知基因 2个。　结论　肾癌的发生。

关键词：肾癌酵母双杂交文库筛选 TCF4相关蛋白