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中华中医药杂志 2021年第4期36卷 1912-1916页

作者：周梦琪冯琬迪盖聪马浩洁赵海虹张宇昕张锦坤杨璐平孙红梅北京中医药大学中医学院解剖教研室北京102488

目的:通过对补阴牵正方抗氧化应激减少帕金森病(PD)细胞模型凋亡的研究,探讨中药治疗PD的作用机制。方法:利用1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导构建PD细胞模型,将SH-SY5Y细胞分为正常组、模型组和中药组。采用CCK-8法检测细胞存活率,流... 详细信息

目的:通过对补阴牵正方抗氧化应激减少帕金森病(PD)细胞模型凋亡的研究,探讨中药治疗PD的作用机制。方法:利用1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导构建PD细胞模型,将SH-SY5Y细胞分为正常组、模型组和中药组。采用CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率和活性氧(ROS)水平,酶标仪检测细胞丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力,Western blot检测细胞色素C(Cyt C)蛋白的表达。结果:与正常组比较,MPP+处理后,细胞存活率和SOD活力显著下降(P补阴牵正方可以改善氧化应激,减少PD细胞模型凋亡,从而发挥对PD的神经保护作用。

关键词：补阴牵正方帕金森病细胞模型氧化应激细胞凋亡

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补阴牵正方调控钙稳态抑制PD小鼠DA神经元丢失的机制探讨

补阴牵正方调控钙稳态抑制PD小鼠DA神经元丢失的机制探讨

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作者：赵海虹北京中医药大学

学位级别：硕士

研究背景帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是世界上发病率第二高的神经退行性疾病,好发于中老年人,中国的患病人数约占世界患病人数的一半,且随着中国老龄化人口的增加,发病率呈逐年增加趋势。PD的典型病理改变为中脑黑质多巴胺（Do... 详细信息

研究背景帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是世界上发病率第二高的神经退行性疾病,好发于中老年人,中国的患病人数约占世界患病人数的一半,且随着中国老龄化人口的增加,发病率呈逐年增加趋势。PD的典型病理改变为中脑黑质多巴胺（Dopamine,DA）神经元变性死亡,导致纹状体DA减少,出现运动迟缓、肌强直、静止性震颤等运动症状以及便秘、吞咽困难、睡眠障碍、抑郁等非运动症状。PD的发病原因复杂,近年来细胞凋亡与Ca2+关系的研究增多,普遍认为钙稳态失衡导致DA神经元凋亡进而引发PD是其主要机制之一。目前PD尚无根治方法,多使用多巴胺替代药物、单胺氧化酶抑制剂、儿茶酚氧位甲基转移酶抑制剂、抗胆碱能药等药物治疗,对于临床症状有一定的改善作用,但存在长期使用疗效降低、副作用明显等问题。在整体观思想指导下的传统中医学,凭借辨证论治的独特理论体系,利用诸多中药不同功效的发挥,在PD的治疗中起到重要作用,可明显改善患者的运动症状和非运动症状,且疗效持久稳定、不良反应少。研究证实,肝肾阴虚型PD在临床上所占的比例居各证型之首,其他证型多由此变化而成,滋补肝肾为主的方法治疗PD具有良好效果。补阴牵正方为大补阴丸和牵正散的合方,由治疗PD的常用药物知母、熟地、龟板、僵蚕、全蝎等组成,具有滋补肝肾以治本、息风通络以治标的功效。本课题组前期使用补阴牵正方治疗神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）介导的 PD 模型小鼠,在黑质DA神经元数目和形态方面表现出明显的保护作用。在此基础上,本实验从Ca2+角度,进一步探讨补阴牵正方对PD中DA神经元凋亡的作用机制与调控环节。研究目的本实验从补阴牵正方调节Ca2+稳态的角度,揭示中药复方在PD发病过程中对PD小鼠脑线粒体和内质网功能的保护作用与调控细胞质、线粒体和内质网Ca2+浓度的相关性,探寻补阴牵正方抑制线粒体和内质网途径细胞凋亡和保持Ca2+稳态的环节,进一步阐明补阴牵正方保护DA神经元的分子机制,为临床应用补阴牵正方治疗PD提供实验依据。研究方法实验一补阴牵正方对PD小鼠脑神经元凋亡的抑制作用。实验分3组,①正常组:不做任何处理;②模型组:腹腔注射MPTP;③中药组:除腹腔注射MPTP外,灌胃补阴牵正方水煎剂。爬杆实验和悬挂实验检测小鼠的行为学;免疫荧光法观察中脑黑质TH阳性神经元的变化;高效液相电化学技术检测前脑DA及其代谢产物含量;Tunel法检测中脑黑质神经元凋亡的变化。实验二补阴牵正方对PD小鼠脑内线粒体和内质网功能的影响。实验分组同前。荧光素酶法检测脑组织ATP含量;荧光染色法检测脑组织ROS含量;免疫荧光法观察中脑黑质Cytc阳性细胞的变化;Western Blot技术检测脑组织Cyt c、Caspase-3、GRP78蛋白的表达水平。实验三补阴牵正方对PD小鼠脑内Ca2+和相关通道蛋白的影响。实验分组同前。Ca2+特异性荧光探针分别检测脑组织细胞质游离Ca2+浓度、内质网Ca2+浓度、线粒体Ca2+浓度;Western Blot技术检测线粒体外膜上的VDAC1蛋白、线粒体内膜上的MCU蛋白的表达水平。研究结果实验一:1.在行为学方面:MPTP可造成C57BL/6J小鼠爬杆时间增加、悬挂得分减少。补阴牵正方可使MPTP处理过的小鼠爬杆时间减少、悬挂得分增加。2.在黑质神经元和DA含量方面:MPTP可造成C57BL/6J小鼠脑组织黑质TH阳性神经元数量减少,黑质神经元凋亡率增加,前脑DA及其代谢产物含量降低。补阴牵正方可改善MPTP造成的这些变化,与模型组相比,中药组小鼠黑质TH 阳性神经元数量增加,黑质神经元凋亡率减少,前脑DA含量增加,而前脑DA代谢产物含量无明显差异。实验二:1.在线粒体和内质网功能方面:MPTP可造成C57BL/6J小鼠脑组织ATP减少、ROS增加。补阴牵正方可使MPTP处理过的小鼠脑组织ATP增加、ROS减少;MPTP可增加C57BL/6J小鼠脑组织GRP78蛋白表达。补阴牵正方能够降低MPTP导致的GRP78蛋白过表达。2.在线粒体途径和内质网途径介导的细胞凋亡方面:MPTP可导致C57BL/6J小鼠脑组织Cyt c、Caspase-3蛋白表达增多,同时黑质Cyt c荧光增强。补阴牵正方能够减少MPTP造成的PD小鼠脑组织Cyt c、Caspase-3蛋白的过表达,减少黑质Cyt c的荧光强度。实验三:1.在脑内Ca2+度方面:MPTP可导致C57BL/6J小鼠脑组织内质网Ca2+减少、细胞质Ca2+增加、线粒体Ca2+增加。补阴牵正方能拮抗MPTP造成的这些变化,使小鼠脑组织内质网Ca2+增加、细胞质Ca2+减少、线粒体Ca2+减少。

关键词：补阴牵正方 Ca2+ 多巴胺神经元帕金森病细胞凋亡

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基于Drp1-Ser637磷酸化探讨补阴牵正方对PD小鼠脑线粒体的影响

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北京中医药大学学报 2019年第8期42卷 647-654页

作者：赵海虹强天遥王旭马浩洁周梦琪张锦坤张宇昕冯琬迪柴原高誉珊盖聪孙红梅北京中医药大学中医学院

目的通过帕金森病(PD)小鼠脑动力相关蛋白1(Drp1)和其磷酸化位点丝氨酸637(Ser637)表达的变化及对脑线粒体的影响探讨补阴牵正方防治PD的可能机制。方法选用C57BL/6小鼠72只,随机分为正常组、模型组、补阴牵正方组、美多芭组,每组18只... 详细信息

目的通过帕金森病(PD)小鼠脑动力相关蛋白1(Drp1)和其磷酸化位点丝氨酸637(Ser637)表达的变化及对脑线粒体的影响探讨补阴牵正方防治PD的可能机制。方法选用C57BL/6小鼠72只,随机分为正常组、模型组、补阴牵正方组、美多芭组,每组18只。除正常组外,其余3组小鼠腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)建立PD模型,补阴牵正方组灌胃补阴牵正方水煎剂,每天灌胃2次,连续28 d,美多芭组腹腔注射美多芭,隔天1次,共28 d。爬杆法、抓握法观察小鼠行为学;免疫荧光组化法观察中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数目;荧光素酶法测定脑线粒体三磷酸腺苷(ATP);JC-1法检测脑线粒体膜电位;蛋白印迹法(Western blot)检测脑蛋白Drp1及其磷酸化蛋白Drp1-Ser637表达。结果相比正常组,模型组小鼠爬杆时间延长(P补阴牵正方组小鼠在第14天爬杆时间缩短、握力明显增加(P补阴牵正方组与美多芭组比较其黑质TH数目、ATP水平及膜电位均有差异(P补阴牵正方可能通过下调维持线粒体动态平衡的分裂蛋白Drp1、上调Drp1-Ser637磷酸化位点的表达改善PD小鼠脑线粒体功能,从而保护中脑黑质多巴胺神经元达到防治PD的作用。

关键词：动力相关蛋白1 动力相关蛋白1磷酸化位点丝氨酸637 线粒体帕金森病补阴牵正方小鼠

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基于pink1-RNAi探讨补阴牵正方对帕金森小鼠脑线粒体的保护机制

基于pink1-RNAi探讨补阴牵正方对帕金森小鼠脑线粒体的保护机制

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作者：张锦坤北京中医药大学

学位级别：硕士

研究背景帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)是一种以震颤、肌强直、运动迟缓等为主要临床表现的神经性退行性疾病,多见于中老年人发病。中脑黑质致密部多巴胺(Dopamine,DA)能神经元变性丢失、神经元内出现嗜酸性路易小体(Lewy Body,LB... 详细信息

研究背景帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)是一种以震颤、肌强直、运动迟缓等为主要临床表现的神经性退行性疾病,多见于中老年人发病。中脑黑质致密部多巴胺(Dopamine,DA)能神经元变性丢失、神经元内出现嗜酸性路易小体(Lewy Body,LB)是其主要病理特征。流行病学调查表明,在神经系统疾病中,PD的增长最快(按照患病率,致残和死亡率),全球目前已超过600万人,预计至2040年,该数字会再翻一倍达1200万人以上。目前我国65岁以上人群PD的患病率大约是1.7%,随着老龄化不断推进,至2030年中国PD患者将增至494万,约占全球PD患者的一半。PD发病率的增长不仅降低病人及家属的生活质量,也给社会也带来沉重的医疗及经济负担。PD的发病涉及线粒体功能障碍、神经炎症、细胞凋亡、蛋白质稳态紊乱等多种机制及相互之间的作用。诱导激酶蛋白1(PTEN-inducedkinase1,PINK1)是定于线粒体的丝氨酸/苏氨酸激酶,PINK1可调节其下游Parkin、线粒体分裂融合蛋白,协同调控线粒体的动态平衡,在维持线粒体形态结构与功能中发挥重要作用。其基因和蛋白表达异常所导致的线粒体功能障碍是PD发病的重要机制。至今还没找到治愈PD方法,目前主要的治疗仍是左旋多巴类等西药,但该类药物随时间的推移,会出现耐药性及副作用。现代中医学将PD归为“颤证”,中医药治疗PD历史悠久,中药可有效改善PD患者整体状态,其副作用小,较好地提高患者生存质量。明确其治疗的机制,为开发和推广中医药在临床更广泛的使用提供实验依据具有现实意义。我们课题组前期研究发现大补阴丸和牵正散的合方补阴牵正方(Bu-Yin-Qian-Zheng-Fang,BYQZF)可减轻PD小鼠脑线粒体以及PD细胞线粒体的损伤,保护线粒体的质量。基于此,本研究将采用PD小鼠模型,从pink1基因敲减角度进一步研究补阴牵正方对PD脑中线粒体质量控制的调控机制。研究目的揭示PD小鼠脑线粒体形态结构和功能以及脑线粒体的动态平衡变化与pink1基因的相关性,探求BYQZF是否可通过pink1基因调控PD小鼠脑线粒体动态平衡的相关分子以保护DA神经元,阐明中医药治疗PD的机制,为临床更好地运用奠定实验基础。研究方法第一章构建慢病毒(lentivirus,LVs)介导脑pink1-RNAi小鼠模型:首先构建pink1-RNAi质粒对其进行鉴定;完成慢病毒pink1-RNAi包装,并检测病毒滴度及小鼠脑pink1 mRNA和PINK1的表达。将小鼠分为3组:正常组、阴性对照病毒组和慢病毒pink1-RNAi组。2W每组取3只小鼠,取脑冰冻切片并做相应处理,荧光显微镜下观察各组小鼠左侧纹状体区慢病毒包装pink1-RNAi载体携带的绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)表达。4w后,每组各取3只小鼠,取脑,实时荧光定量(Quantitative Real-time,PCR)测小鼠脑pink1 mRNA 水平,蛋白质印迹法(Western Blot,WB)分别检测小鼠左、右侧脑的PINK1蛋白表达。第二章BYQZF对慢病毒介导脑pink1-RNAi PD小鼠模型的治疗作用:小鼠分6组,每组3只:阴性对照病毒组、阴性对照PD组、阴性对照PD中药组、慢病毒pink1-RNAi组、慢病毒pink1-RNAi PD组、慢病毒pink1-RNAi PD中药组。通过记录爬杆时间、悬挂得分评价各组小鼠的运动协调能力;用免疫荧光法观察各组小鼠黑质DA神经元的变化;高效液相色谱法检测各组小鼠脑DA及相关代谢产物二羟苯乙酸(dihydroxy-phenyl acetic acid,DOPAC)、高香草酸(homovanillic acid,HVA)水平。第三章BYQZF对慢病毒介导脑pink1-RNAiPD小鼠模型脑线粒体质量的影响:小鼠分组同第二章;通过透射电镜观察小鼠黑质神经元超微结构变化。荧光素酶法检测脑线粒体ATP水平、比色法测定脑线粒体呼吸链复合体Ⅰ酶活性。Western Blot检测小鼠脑PINK1和Parkin蛋白水平;检测脑线粒体融合蛋白1(Mitofusin 1,Mfn1)、融合蛋白2(Mitofusin 1,Mfn2)和视神经萎缩蛋白1(Optic atrophy 1,Opa1)水平;检测线粒体分裂动力相关蛋白1(Dynamic related protein 1,Drp1)和线粒体分裂蛋白1(Mitochondrial fission protein 1,Fis1)水平。采用免疫荧光双标技术及荧光显微镜观察:PINK1 与 Parkin、PINK1 与 Tom20 以及 Parkin 与 Tom20 的共定位。研究结果第一章结果1.慢病毒pin

关键词：帕金森病补阴牵正方 PINK1 线粒体

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基于Parkin基因探讨补明牵正方对帕金森病细胞模型线粒体的保护作用

基于Parkin基因探讨补明牵正方对帕金森病细胞模型线粒体的保护作...

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作者：柴原北京中医药大学

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研究背景帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是一种老年神经退行性疾病,其发病率仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）。PD以中脑黑质区多巴胺（Dopamine,DA）能神经元变性、缺失和路易小体形成为主要病理改变,出现静止性... 详细信息

研究背景帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是一种老年神经退行性疾病,其发病率仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）。PD以中脑黑质区多巴胺（Dopamine,DA）能神经元变性、缺失和路易小体形成为主要病理改变,出现静止性震颤、肌强直、运动迟缓等特征性运动障碍和非运动性症状如:睡眠障碍、自主神经障碍等。其发病原因目前并不十分清楚,普遍认为与遗传、环境和年龄老化等因素有关。在PD研究中发现,其发病机制与线粒体密切相关,而Parkin是最常见的PD遗传易感基因之一,其突变或缺失可导致线粒体形态和功能改变,引发PD样症状,目前已成为研究PD发病机制的热点之一。PD治疗多以对症治疗为主,临床多采用左旋多巴及多巴胺受体激动剂的联合的治疗方案,虽然能在一定程度上缓解其症状,但长时间使用会出现药效减退,开关现象等副作用。中医临床治疗因其独特的理论体系和辨证论治的思想,取得了较为稳定的疗效。补阴牵正方（Bu-Yin-Qian-Zheng Formula,BYQZF）是由临床常用方剂大补阴丸（Da-Bu-Yin-Wan,DBYW）和牵正散（Qian-Zheng-San,QZS）组成的合方。本课题组在前期的实验研究中已明确了中药复方DBYW合QZS可以调控PD小鼠脑部线粒体酶复合物的活性及其基因表达,减轻线粒体DNA的损伤,在体外实验中证实其对MPP+介导的PD模型细胞线粒体功能具有明确的保护作用。在此研究的基础上,本实验以Parkin基因为切入点,通过现代分子生物学技术与传统中医理论相结合从细胞、分子水平,进一步探究BYQZF对PD细胞模型线粒体保护的作用环节和机制。研究目的本研究从Parkin基因角度,以线粒体为中心,揭示BYQZF对PD细胞模型中线粒体的保护作用,阐明BYQZF对PD中线粒体形态和功能的保护与Parkin基因调控的相关性,揭示BYQZF与Parkin蛋白及线粒体分裂和融合蛋白之间的联系,深入探寻BYQZF维持PD细胞模型中线粒体动态平衡的作用环节和分子机制。为中医临床应用提供进一步的实验依据,为中药的新药研究和开发奠定基础。研究方法实验一 Parkin基因敲减细胞模型的构建:采用RNAi技术构建Parkin敲减质粒并瞬时转染SH-SY5Y细胞,实验分3组:①正常对照组,不进行转染;②阴性对照组,转染阴性质粒;③Parkin敲减组,转染Parkin敲减质粒。荧光显微镜观察SH-SY5Y细胞转染情况;流式细胞仪检测GFP表达率;RT-qPCR技术检测Parkin mRNA的表达;Western Blot技术检测Parkin蛋白的表达。实验二补阴牵正方对Parkin基因敲减PD细胞模型线粒体形态和功能的影响:实验分6组:①阴性质粒组,转染阴性质粒;②阴性质粒+MPP+组,转染阴性质粒后给予MPP+造模;③阴性质粒+MPP＋+中药组,转染阴性质粒后给予MPP+造模并进行中药干预;④Parkin敲减组,转染Parkin敲减质粒;⑤Parkin敲减＋MPP+组,转染Parkin敲减质粒后给予MPP+造模;⑥Parkin敲减＋MPP++中药组,转染Parkin敲减质粒后予MPP+造模并进行中药干预。CCK-8法检测各组细胞的存活率;MTR（MitoTracker（?）Red CMXRos,MTR）线粒体探针标记线粒体激光共聚焦扫描显微镜观察线粒体的形态,利用软件分析线粒体形态因子、网络平均分支长度和数量及线粒体活性;荧光素酶法检测细胞中ATP水平;线粒体探针TMRM检测线粒体膜电位。实验三补阴牵正方对Parkin基因敲减PD细胞模型线粒体动态平衡的影响:分组同实验二。Western Blot技术检测:控制线粒体质量的相关蛋白PINK1和Parkin的表达。免疫荧光双标技术及激光共聚焦扫描显微镜分别观察:①Parkin蛋白与PINK1蛋白在细胞的表达及共定位关系;②Parkin蛋白的亚细胞定位:与MTR线粒体探针共标记。Western Blot技术检测:①线粒体融合相关蛋白Mfn１、Mfn2及OPA1的表达;②线粒体分裂相关蛋白Fis１和Drp１的表达。研究结果实验一结果:1.转染情况的观察:阴性对照组及Parkin敲减组能够观察到较多的绿色荧光,绿色荧光蛋白表达率增加（转染质粒携带绿色荧光蛋白）。*** mRNA及蛋白表达的检测:Parkin敲减组细胞内的Parkin mRNA和蛋白的表达均显著降低,提示Parkin基因低表达细胞模型成功。实验二结果:1.细胞存活率的变化:转染阴性质粒的SH-SY5Y细胞用神经毒素MPP+处理后细胞存活率明显下降,中药BYQZF处理后其细胞存活率显著提高,而parkin敲减组细胞较阴性质粒组细胞存活率明显下降。parkin敲减细胞用MPP＋造模其

关键词：帕金森病补阴牵正方 Parkin MPP+ 线粒体

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